hTERT基因修飾雪旺細(xì)胞移植對(duì)脊髓損傷大鼠損傷區(qū)神經(jīng)修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的：以逆轉(zhuǎn)錄病毒PLXSN為載體，將hTERT基因轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的大鼠雪旺細(xì)胞，檢測(cè)雪旺細(xì)胞端粒酶活性及細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。進(jìn)一步探討hTERT基因修飾雪旺細(xì)胞移植對(duì)脊髓損傷大鼠損傷區(qū)神經(jīng)修復(fù)相關(guān)相關(guān)白表達(dá)的檢測(cè)及對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。
　　方法：體外培養(yǎng)大鼠雪旺細(xì)胞，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒PLXSN為載體介導(dǎo)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞，體外培養(yǎng) Wistar大鼠雪旺細(xì)胞，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒PLXSN為載體介導(dǎo)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶

2、(hTERT)基因轉(zhuǎn)染，分為3組：對(duì)照組、陰性轉(zhuǎn)染組、hTERT轉(zhuǎn)染組。用RT-PCR，Western blot檢測(cè)雪旺細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前后hTERT基因和蛋白的表達(dá)。應(yīng)用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、MTT比色法觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的優(yōu)化作用；采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期分布的變化。成年雌性Wistar大鼠71只，造模成功66只,隨機(jī)分為對(duì)照組，SCs組，hTERT-SCs組,22只/組，按照改良的Allen打擊法建立大鼠急性脊髓損傷模型。分別于造模前、造模后1天、

3、3天、1周、2周、3周、4周通過(guò)BBB評(píng)分、斜板試驗(yàn)、改良的Tarlov評(píng)分進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定。造模后72 h通過(guò)RT—PCR、Western blot檢測(cè)脊髓損傷區(qū)周?chē)鶤QP4/9、MMP9/2基因轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。造模后4周，HE染色及熒光顯微鏡觀測(cè)PKH-26標(biāo)記的SCs存活及分布情況，通過(guò)免疫組化法檢測(cè)GFAP、Nogo及NF200的表達(dá)量，行HRP示蹤觀察神經(jīng)纖維再生情況，通過(guò)SEP和MEP觀察大鼠

4、神經(jīng)電生理恢復(fù)情況。
　　結(jié)果：通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒PLXSN介導(dǎo)的hTERT基因轉(zhuǎn)染大鼠雪旺細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染hTERT后，hTERT轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組、陰性轉(zhuǎn)染組相比hTERT基因和蛋白水平均有表達(dá)，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯增快，細(xì)胞周期 G0/G1期減少，S期細(xì)胞數(shù)增多。各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。RT-PCR，Western blot檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染hTERT基因的大鼠雪旺細(xì)胞體外能表達(dá)hTERT；大鼠下肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)hTERT-SCs組優(yōu)

5、于SCs組，SCs組優(yōu)于對(duì)照組。造模后72小時(shí) hTERT-SCs組細(xì)胞凋亡指數(shù)均明顯低于對(duì)照組（p<0.05）.造模后72小時(shí)，與對(duì)照組相比 hTERT-SCs組AQP4/9基因和蛋白表達(dá)均較顯著降低(p＜0.05）。造模后4周，HE染色對(duì)照組可見(jiàn)脊髓組織缺失及脊髓空洞形成，無(wú)神經(jīng)軸索通過(guò)。SCs組損傷區(qū)可見(jiàn)少量神經(jīng)軸索樣結(jié)構(gòu)，脊髓空洞較小，hTERT-SCs組可見(jiàn)較多神經(jīng)軸索樣結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)脊髓空洞。PKH-26標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：hTE

6、RT-SCs組最多，SCs組次之，對(duì)照組最少，且各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。造模后4周，hTERT-SCs組膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）、神經(jīng)絲蛋白（NF-200）的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，差異有顯著性意義（p<0.05），hTERT-SCs組Nogo蛋白的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低，差異有顯著性意義（p<0.05），HRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維數(shù)：hTERT-SCs組最多，SCs組次之，對(duì)照組最少，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05

7、）。SEP和MEP的潛伏期：hTERT-SCs組SCs組>對(duì)照組，且各組之間差異有顯著性意義(p<0.05)。
　　結(jié)論：通過(guò)轉(zhuǎn)錄病毒PLXSN為載體介導(dǎo)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因轉(zhuǎn)染使雪旺細(xì)胞端粒酶活性明顯升高，能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠雪旺細(xì)胞增殖。hTERT基因修飾雪旺細(xì)胞移植可促進(jìn)脊髓損傷大鼠神經(jīng)突觸的再生，降低脊髓損傷區(qū)周?chē)?A