LPS-LBP復(fù)合物與CD14結(jié)合位點噬菌體克隆的篩選.pdf

1、脂多糖(LPS)，是革蘭氏陰性細菌外壁的主要成分，可致內(nèi)毒素性急性呼吸窘迫綜合征，目前尚無理想的抗內(nèi)毒素治療藥物。正常情況時人體內(nèi)LPS的水平很低，即使在革蘭陰性菌膿毒血癥時，血漿中LPS濃度僅為0.01～1ng/ml[1]。LPS發(fā)揮致炎作用需要LBP/CD14的增敏效應(yīng)。脂多糖結(jié)合蛋白是脂多糖的結(jié)合蛋白，能將LPS單體轉(zhuǎn)運至脂蛋白后通過肝臟從體內(nèi)清除，并可以將LPS遞呈給位于單核巨噬細胞及中性粒細胞表面的受體CD14，形成LPS/L

2、BP/CD14三聯(lián)復(fù)合物，啟動LPS炎癥信號通路，誘發(fā)級聯(lián)炎癥效應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)毒素性急性呼吸窘迫綜合征。LPS/LBP復(fù)合物與CD14結(jié)合是啟動LPS炎癥信號通路的關(guān)鍵點，尋找LPS/LBP復(fù)合物與CD14的結(jié)合位點模擬肽，可以早期阻斷LPS炎癥信號通路。因此，本研究擬構(gòu)建LPS/LBP復(fù)合物，并以LPS/LBP復(fù)合物為底物進行噬菌體十二肽庫篩選，獲得與LPS/LBP復(fù)合物具有較高親和力，并與CD14競爭結(jié)合LPS/LBP復(fù)合物的噬菌體克隆

3、。擬通過后續(xù)DNA測序后獲得LPS/LBP復(fù)合物與CD14的結(jié)合位點的模擬肽，為進一步研究內(nèi)毒性急性呼吸窘迫征的防治策略奠定理論基礎(chǔ)。
　　目的：
　　構(gòu)建LPS/LBP復(fù)合物，篩選LPS/LBP復(fù)合物與CD14結(jié)合位點的噬菌體克隆。
　　方法：
　　1.將LPS與LBP按15∶1、10∶1、5∶1的比例混勻。將LPS/LBP混合物、LBP(濃度分別為200ug/ml和100ug/ml、50ug/ml)、LPS(

4、濃度分別為100ug/ml、50ug/ml)過夜孵育。將LPS/LBP混合物、LBP、LPS行凝膠電泳，經(jīng)考馬斯亮藍染色后將各條帶切取，行蛋白回收，并測定內(nèi)毒素。
　　2.采用噬菌體肽庫篩選技術(shù)，以LPS/LBP復(fù)合物包被酶標板，行親和篩選，經(jīng)過4輪洗脫，使噬菌體得到有效富集。隨后分次挑取47個和95個噬菌體克隆，行結(jié)合活性實驗，將親和活性大于2倍以上的噬菌體克隆行競爭抑制實驗，最終得到與LPS/LBP復(fù)合物有親和力且能與CD14

5、競爭性結(jié)合LPS/LBP復(fù)合物的噬菌體克隆。
　　結(jié)果：
　　1.凝膠電泳后，LPS/LBP復(fù)合物、LBP泳道于52KDa處可見考馬斯亮蘭染色的條帶。樣本中LBP濃度越高、條帶染色越濃，LPS泳道對應(yīng)于52KDa處無染色條帶出現(xiàn)。各濃度比例的LPS/LBP復(fù)合物電泳后凝膠條帶回收物中均能檢測出內(nèi)毒素。10∶1LPS/LBP復(fù)合物組、15∶1LPS/LBP復(fù)合物組復(fù)合物內(nèi)毒素濃度顯著高于5∶1LPS/LBP復(fù)合物組內(nèi)毒素濃度(

6、P＜0.05)。10∶1LPS/LBP復(fù)合物組與15∶1LPS/LBP復(fù)合物組內(nèi)毒素濃度無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.1)。各濃度LBP組均未檢出內(nèi)毒素，LPS組內(nèi)毒素檢測也為陰性。
　　2.以LPS/LBP復(fù)合物為底物行親和篩選，經(jīng)過4輪洗脫，富集率由2.35×106增加到4.25×10-5，噬菌體克隆得到有效富集。第一次結(jié)合活性實驗隨機挑選47個克隆進行ELISA鑒定其與LPS/LBP復(fù)合物的的結(jié)合力，結(jié)果顯12個噬菌體克隆所展示的多

7、肽與LPS/LBP復(fù)合物有較高的結(jié)合力，OD450高于對照組2倍以上。第二次結(jié)合活性實驗隨機挑取95個噬菌體克隆行結(jié)合活性實驗，34個噬菌體克隆與LPS/LBP復(fù)合物有較高親和力，OD450高于對照組2倍以上。將這46個噬菌體克隆行競爭抑制實驗，有34個噬菌體能與CD14競爭性結(jié)合LPS/LBP復(fù)合物，競爭抑制力較高的是2-27、2-34、2-50這三個噬菌體克隆。
　　結(jié)論：
　　1.通過溫孵及凝膠電泳可獲得純度較高的LP