黑色素瘤細(xì)胞特異性穿膜肽的篩選及其結(jié)構(gòu)功能分析.pdf

1、目的：穿膜肽即細(xì)胞膜穿透肽，是一類能穿透細(xì)胞膜或核膜的短肽。早期穿膜肽對細(xì)胞的識別缺乏特異性，因而在抗腫瘤治療應(yīng)用中大大被限制。噬菌體展示技術(shù)是一項(xiàng)用來篩選特定蛋白質(zhì)或多肽的技術(shù)，其方法是將外源蛋白質(zhì)或多肽展示在噬菌體表面，其對應(yīng)的編碼基因整合在噬菌體基因組中。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)腫瘤細(xì)胞表面分子的特異性，運(yùn)用噬菌體展示技術(shù)，旨在篩選出小鼠黑色素瘤細(xì)胞特異性穿膜肽，從而為惡性黑色素瘤的靶向治療尋求更簡便而有效的方法。
　　方法：(1)以小鼠

2、黑色素瘤細(xì)胞為目的細(xì)胞，將已導(dǎo)入外源基因的噬菌體庫與小鼠黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行孵育-洗脫-擴(kuò)增，循環(huán)篩選4-6次，對篩選出的噬菌體DNA進(jìn)行序列測定，獲取其外源插入序列，將插入序列進(jìn)行比對、分析，初步獲得能特異性結(jié)合小鼠黑色素瘤細(xì)胞的短肽，將其命名為MT23。(2)分別合成帶有熒光標(biāo)記的MT23-FITC、TAT-FITC、NCO-FITC短肽，將這些短肽與多種細(xì)胞體外共孵育，熒光顯微鏡觀察或熒光酶標(biāo)儀定量分析各細(xì)胞內(nèi)的熒光分布，并比較不同條

3、件下細(xì)胞內(nèi)熒光量的變化。(3)通過乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞膜穿透肽對細(xì)胞膜完整性的影響，通過MTT檢測細(xì)胞膜穿透肽對細(xì)胞增殖的影響。(4)構(gòu)建Apoptin、MT23-Apoptin原核表達(dá)質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)Apoptin、MT23-Apoptin融合蛋白，經(jīng)尿素洗脫、復(fù)性后Western blot法檢測蛋白的正確性。(5)TUNEL法檢測Apoptin、MT23-Apoptin融合蛋白體外誘導(dǎo)小鼠黑色素

4、瘤細(xì)胞凋亡的生物學(xué)活性。
　　結(jié)果：(1)通過噬菌體展示技術(shù)，成功篩選出特異性結(jié)合B16細(xì)胞的含肽噬菌體并確定了其插入的外源DNA序列。(2)合成了帶有熒光FITC標(biāo)記的細(xì)胞膜穿透肽，將這些肽處理各組細(xì)胞珠后，實(shí)驗(yàn)組中B16細(xì)胞內(nèi)有明顯的熒光分布，而其它細(xì)胞內(nèi)未見熒光或熒光極少。(3)MT23并不影響細(xì)胞膜的完整性，對細(xì)胞的增殖也影響極小。(4)成功構(gòu)建出Apoptin、MT23-Apoptin原核表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)并純化蛋白，且

5、經(jīng)Western blot法檢測純化的蛋白均正確。(5)MT23-Apoptin融合蛋白能夠誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡，而單獨(dú)的Apoptin蛋白不能誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論:運(yùn)用噬菌體展示技術(shù)可以成功篩選出小鼠黑色素瘤細(xì)胞特異性穿膜肽，并經(jīng)過熒光驗(yàn)證其具有良好的特異性穿膜效應(yīng)，細(xì)胞膜穿透肽對細(xì)胞膜的完整性并不影響，此外細(xì)胞膜穿透肽可攜帶Apoptin進(jìn)入小鼠黑色素瘤細(xì)胞發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的生物活性。本實(shí)驗(yàn)為黑色素瘤的靶向治療提供了新的思