大腸桿菌O157：H7糖綴合物疫苗的生物法合成及免疫學(xué)研究.pdf

1、大腸桿菌(E.coli) O157∶H7是嚴(yán)重的腸道致病菌，通常引起腹瀉、出血性結(jié)腸炎、溶血性尿毒癥等。傳統(tǒng)的抗生素治療會(huì)引起腸道內(nèi)E.coliO157∶H7細(xì)胞裂解并向腸道黏膜釋放志賀樣毒素等，有加重病情的風(fēng)險(xiǎn)。疫苗作為替代手段，對(duì)預(yù)防E.coli O157∶H7的感染具有重要意義。
　　O-抗原或O-PS，作為脂多糖的重要組成部分，暴露在細(xì)菌外表面，是機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別的重要靶點(diǎn)。O-PS是不依賴于T細(xì)胞的抗原。O-PS免疫機(jī)體

2、主要產(chǎn)生抗O-PS的IgM抗體，幾乎不產(chǎn)生IgG抗體以及T細(xì)胞記憶，需要按期重復(fù)接種來(lái)維持免疫力，并且不能在免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全的小于2周歲的嬰幼兒、免疫力低下的老年人等人群中產(chǎn)生足夠的免疫力。通過(guò)將O-PS連接到載體蛋白上，形成的糖綴合物是依賴于T細(xì)胞的抗原。糖綴合物免疫機(jī)體產(chǎn)生的抗O-PS抗體從IgM向IgG、IgA等轉(zhuǎn)換，并產(chǎn)生T細(xì)胞記憶，不僅能在健康成年人體內(nèi)產(chǎn)生持久的免疫力，而且針對(duì)嬰幼兒、免疫力底下的老年人同樣有效。
　

3、　糖綴合物疫苗，公認(rèn)為是最有效和最安全的抗菌疫苗之一。為了有效預(yù)防E.coli O157∶H7的感染，本論文針對(duì)E.coli O157∶H7的O-PS進(jìn)行了糖綴合物疫苗的生物法合成及免疫學(xué)研究。
　　本論文分為三部分研究?jī)?nèi)容。第一部分是生物法合成糖綴合物疫苗（第二章）;第二部分是糖綴合物疫苗O-PS-MBP的免疫學(xué)評(píng)價(jià)（第三章）;第三部分是載體蛋白及其不同位置多肽對(duì)糖綴合物疫苗抗多糖IgG滴度和亞型的影響（第四章）。
　　第

4、一部分:
　　糖綴合物疫苗的合成通常采用化學(xué)法。但是化學(xué)法存在著生產(chǎn)成本高、質(zhì)量難以控制、容易有批次間的差異等局限性。本部分我們采用基于空腸彎曲菌(C.jejuni)N-糖基化系統(tǒng)的體內(nèi)酶法合成糖綴合物疫苗。糖基轉(zhuǎn)移酶PglB是C.jejuni的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)將糖鏈從類萜類脂載體連接到載體蛋白的氨基酸序列D/E-X-N-Y-S/T(X，Y≠P)的天冬酰胺(N)殘基上。利用來(lái)自C.jejuni的N-糖基化系統(tǒng)和E.coli O-PS合

5、成途徑比較相似的特點(diǎn)，將C.jejuni N-糖基化系統(tǒng)的關(guān)鍵酶PglB的基因、E.coliO157∶H7O-PS合成基因、載體蛋白（麥芽糖結(jié)合蛋白MBP、CRM197或AcrA）合成基因?qū)氲角贸腔D(zhuǎn)移酶基因waal的宿主菌E.coliW3110中，從而建立E.coli的N-糖基化系統(tǒng)。利用E.coli N-糖基化系統(tǒng)生產(chǎn)糖綴合物疫苗，具有構(gòu)建方式靈活、一次發(fā)酵、純化條件簡(jiǎn)單、成本低的特點(diǎn)，滿足大規(guī)模制備的要求。同時(shí)，利用E.col

6、i N-糖基化系統(tǒng)生產(chǎn)的糖綴合物疫苗糖基化位點(diǎn)、糖鏈長(zhǎng)度等明確并可控，且生產(chǎn)批次之間沒有差異，滿足作為疫苗的質(zhì)量要求。
　　然后通過(guò)對(duì)重組菌的誘導(dǎo)、蛋白的表達(dá)和純化，得到的糖綴合物經(jīng)過(guò)定性分析（包括考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)、western blot檢測(cè)、MALDI-TOF檢測(cè)、糖組成分析），得到了3個(gè)連有E.coli O157∶H7O-PS的、載體蛋白不同的糖綴合物O-PS-MBP、O-PS-CRM、O-PS-AcrA。又通過(guò)定量分析得

7、知，O-PS-MBP、O-PS-CRM、O-PS-AcrA的得率約為0.5～1 mg/L（蛋白定量），且O-PS-MBP和O-PS-CRM的糖基化比例比O-PS-AcrA更高。利用E.coli N-糖基化系統(tǒng)生產(chǎn)糖綴合物O-PS-MBP、O-PS-CRM、O-PS-AcrA，開辟了一條合成E.coli O157∶H7疫苗的新途徑，具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　第二部分:
　　適應(yīng)性免疫應(yīng)答分為體液免疫和細(xì)胞免疫。之前報(bào)道的抗E.

8、coli O157∶H7的糖綴合物疫苗O-PS-rEPA和O-PS-Stx，更多關(guān)注的是其產(chǎn)生抗E.coli O157∶H7多糖抗體的能力，即體液免疫。幾乎沒有文獻(xiàn)報(bào)道糖綴合物疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生的細(xì)胞免疫，包括T細(xì)胞的增殖和分化、細(xì)胞因子的分泌等。現(xiàn)在，有越來(lái)越多的研究表明細(xì)胞免疫在抗菌感染的重要作用，而且其作用時(shí)間比抗體更加持久。
　　目前的嬰幼兒計(jì)劃免疫中有很多疫苗是糖綴合物疫苗。然而，同時(shí)或先后免疫接種多種糖綴合物疫苗時(shí)，如果

9、載體蛋白相同，可能會(huì)引起免疫抑制等負(fù)面作用。面對(duì)日益增多的新型的糖綴合物疫苗，除了廣泛應(yīng)用的載體蛋白外，急需尋找和開發(fā)新的載體蛋白。目前，探索新型載體蛋白主要集中在尋找含有T細(xì)胞表位的蛋白、有Toll樣受體特性的蛋白等。最近，人們開始關(guān)注MBP在免疫學(xué)上的價(jià)值和應(yīng)用。一些具有抗腫瘤、抗菌或抗寄生蟲的活性蛋白在和MBP融合表達(dá)后活性明顯提高。研究證明MBP有TLR4激動(dòng)劑的性質(zhì)，可促進(jìn)Th1細(xì)胞的活化，并有激活樹突狀細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞、促

10、進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞的增殖等作用。然而，目前還沒有文獻(xiàn)報(bào)道MBP作為糖綴合物疫苗的載體蛋白以及MBP對(duì)糖綴合物疫苗的免疫增強(qiáng)作用。
　　本部分，我們用以MBP作為載體蛋白的糖綴合物O-PS-MBP免疫BALB/c小鼠，檢測(cè)O-PS-MBP激活的體液免疫和細(xì)胞免疫。體液免疫方面，O-PS-MBP激活小鼠產(chǎn)生了抗E.coliO157∶H7多糖的血清IgG、IgM和腸道IgA。并且，O-PS-MBP免疫血清在補(bǔ)體環(huán)境中可以有效殺死E.coli

11、 O157∶H7。細(xì)胞免疫方面，O-PS-MBP促進(jìn)脾臟淋巴CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的增殖。此外通過(guò)分析得出，O-PS-MBP免疫血清中IFN-γ、抗E.coli O157∶H7多糖IgG2a含量較高，說(shuō)明O-PS-MBP刺激小鼠機(jī)體偏向Th1型免疫應(yīng)答。進(jìn)一步地，通過(guò)ELISPOT分析發(fā)現(xiàn)，MBP無(wú)論是單獨(dú)免疫還是以糖綴合物的形式免疫，都能刺激機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ，抑制產(chǎn)生IL-4,說(shuō)明載體蛋白MBP使O-PS-MBP偏向Th1型

12、細(xì)胞免疫應(yīng)答，有很好的免疫增強(qiáng)作用。以MBP作為糖綴合物疫苗的載體蛋白具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　第三部分:
　　糖綴合物疫苗激活機(jī)體產(chǎn)生抗多糖抗體，并通過(guò)多糖抗體介導(dǎo)的調(diào)理素或補(bǔ)體作用吞噬病菌，達(dá)到清除病菌、保護(hù)機(jī)體的作用。糖綴合物疫苗產(chǎn)生的抗多糖IgG抗體是體液免疫應(yīng)答的重要組成部分，IgG抗體滴度的高低直接決定著糖綴合物疫苗的免疫效果。IgG根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可分為不同的亞型，包括IgG1、IgG2、IgG3等。不同的Ig

13、G亞型有不同的功能和特點(diǎn)。同時(shí)，IgG亞型分布反應(yīng)了Th細(xì)胞免疫應(yīng)答的方向（Th1或Th2）。研究糖綴合物疫苗引起的IgG亞型的分布或Th細(xì)胞分化的方向，對(duì)評(píng)價(jià)糖綴合物疫苗免疫機(jī)制和效果有重要意義。
　　本部分，我們通過(guò)多肽免疫小鼠實(shí)驗(yàn)和不同載體蛋白的糖綴合物疫苗免疫小鼠實(shí)驗(yàn)，探討了載體蛋白及其不同位置多肽對(duì)糖綴合物疫苗抗多糖IgG滴度和亞型的影響。
　　首先是載體蛋白及其不同位置多肽對(duì)糖綴合物疫苗抗多糖IgG滴度的影響。通

14、過(guò)ELISA檢測(cè)3個(gè)載體蛋白不同的糖綴合物疫苗O-PS-MBP、O-PS-CRM、O-PS-AcrA分別免疫小鼠后的血清，結(jié)果發(fā)現(xiàn)載體蛋白不同的糖綴合物疫苗產(chǎn)生的抗多糖IgG滴度不同。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道，載體蛋白對(duì)糖綴合物疫苗抗多糖抗體有促進(jìn)和抑制作用。然而，臨床結(jié)果沒有規(guī)律可循，也沒有明確的機(jī)制去解釋這種現(xiàn)象。通過(guò)以載體蛋白MBP上3個(gè)不同位置的多肽分別前免疫，以O(shè)-PS-MBP后免疫，檢測(cè)多肽對(duì)O-PS-MBP抗多糖抗體的促進(jìn)或抑制作

15、用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)載體蛋白MBP中靠近糖基化位點(diǎn)或者糖基化位點(diǎn)處的多肽，相比遠(yuǎn)離糖基化位點(diǎn)的多肽，對(duì)糖綴合物疫苗O-PS-MBP產(chǎn)生抗E.coli O157∶H7多糖IgG有明顯促進(jìn)作用。因此，載體蛋白的促進(jìn)或抑制作用和糖綴合物疫苗的糖基化位點(diǎn)的多少有密切關(guān)系。后免疫的糖綴合物疫苗的糖基化位點(diǎn)越多，靠近糖基化位點(diǎn)的或糖基化位點(diǎn)處的多肽就越多，越會(huì)發(fā)生促進(jìn)現(xiàn)象;相反，糖基化位點(diǎn)越少，靠近糖基化位點(diǎn)的或糖基化位點(diǎn)處的多肽就越少，越會(huì)發(fā)生抑制現(xiàn)象。

16、
　　其次是檢測(cè)載體蛋白及其不同位置多肽對(duì)糖綴合物疫苗抗多糖抗體IgG亞型的影響。盡管糖綴合物疫苗的抗多糖IgG亞型分布與抗載體蛋白IgG亞型分布不一致，但是通過(guò)比較MBP和O-PS-MBP免疫血清中抗不同位置多肽的IgG亞型發(fā)現(xiàn)，與MBP相比，O-PS-MBP抗靠近糖基化位點(diǎn)的或糖基化位點(diǎn)處的多肽的IgG2a顯著降低，而免疫O-PS-MBP產(chǎn)生的抗多糖抗體以IgG2a為主。由于靠近糖基化位點(diǎn)的或糖基化位點(diǎn)處的多肽包含有糖綴合物降

17、解形成的寡糖-多肽中的部分多肽，由此，我們可以推斷得出，寡糖-多肽中的抗多肽的IgG亞型分布和抗寡糖的IgG亞型分布是一致的。
　　綜上所述，寡糖-多肽的多肽可促進(jìn)糖綴合物疫苗中抗多糖抗體IgG的產(chǎn)生，并且影響抗多糖抗體的IgG亞型分布。因此，通過(guò)改變糖綴合物疫苗的糖基化位點(diǎn)的個(gè)數(shù)或改變糖基化位點(diǎn)的位置，可控制糖綴合物疫苗抗多糖IgG的滴度和亞型分布。
　　總之，本論文通過(guò)建立E.coli N-糖基化系統(tǒng)為生產(chǎn)糖綴合物疫苗開