融合蛋白CTP-FoxM1對小鼠骨髓來源樹突狀細胞免疫活化作用的初步研究.pdf

1、目的:初步探討融合蛋白CTP-FoxM1對小鼠骨髓來源DCs的免疫活化作用,為探索其是否能夠在體內(nèi)發(fā)揮免疫效應(yīng)奠定基礎(chǔ)。
　　方法:(1)無菌條件下分離小鼠骨髓來源的細胞,紅細胞裂解液裂解紅細胞后, GM-CSF聯(lián)合IL-4體外誘導(dǎo)培養(yǎng)細胞至第7d,光鏡下觀察細胞的形態(tài),流式細胞術(shù)分析檢測細胞表面分子 CD40、CD80、CD86及MHC-Ⅱ的表達情況, ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-12的釋放水平, MLR檢測細胞刺激同種

2、異體淋巴細胞的能力。
　　(2)融合蛋白 CTP-FoxM1、CTP、FoxM1分別作用 DCs48h后, CCK-8試劑盒檢測其存活率,流式細胞術(shù)檢測其表面分子表達情況, ELISA法檢測其培養(yǎng)上清中IL-12的分泌水平。
　　(3) DCs經(jīng)融合蛋白CTP-FoxM1、CTP、FoxM1作用48h后,與小鼠脾臟來源的CD8+T細胞共同培養(yǎng)72h, ELISA試劑盒檢測上清液中IFN-γ、TNF-α的分泌情況。
　　

3、結(jié)果:(1)從每只小鼠的骨髓可獲得約3×107個細胞,光學(xué)顯微鏡下可見細胞伸出“樹枝狀”突起,經(jīng)流式細胞儀檢測,細胞表面標(biāo)志性分子CD11c表達量為88±4.66％,與未經(jīng)LPS刺激的細胞相比,經(jīng)LPS刺激的細胞表面分子表達量明顯增高（P＜0.001）,其培養(yǎng)上清中的IL-12水平增高（P＜0.001）。結(jié)果表明通過該方法成功獲得較高純度的DCs。MLR實驗顯示經(jīng)DCs作用后的T細胞其增殖率明顯較未經(jīng)DCs作用的T細胞高(P＜0.01)

4、,表明經(jīng)該方法分離誘導(dǎo)培養(yǎng)的DCs具有較強的刺激T淋巴細胞增殖的能力。
　　(2) CTP-FoxM1對 DCs的存活有抑制作用,且在一定范圍內(nèi)與濃度呈正相關(guān)。與蛋白CTP、FoxM1相比，CTP-FoxM1可明顯上調(diào)DCs表面分子 CD40、CD80、CD86及 MHC-Ⅱ的表達量(P＜0.001),促進DCs培養(yǎng)上清中IL-12的分泌(P＜0.001)。
　　(3)將融合蛋白 CTP-FoxM1、CTP、FoxM1抗原負

5、載的 DCs與CD8+T淋巴細胞共培養(yǎng), CTP-FoxM1組上清液中細胞因子 IFN-γ、TNF-α的分泌量較CTP組(P＜0.001, P＜0.001)和FoxM1組高(P＜0.001, P＜0.01)。
　　結(jié)論:(1)經(jīng)本實驗室改進，紅細胞裂解法能夠分離出純度較高的DCs,可以滿足后續(xù)實驗;
　　(2)融合蛋白CTP-FoxM1能夠上調(diào)DCs表面分子表達,誘導(dǎo)IL-12分泌,具有免疫活化DCs的潛能。
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