NFκB上調(diào)USP16基因的轉(zhuǎn)錄及其分子機(jī)制研究.pdf

1、第一部分NFκB上調(diào)USP16基因的轉(zhuǎn)錄及其分子機(jī)制研究
　　目的：泛素特異性蛋白酶USP16在基因表達(dá)、細(xì)胞周期、細(xì)胞自我更新和/或衰老過(guò)程中起重要作用，且其在唐氏綜合癥中的過(guò)度表達(dá)是神經(jīng)功能缺損的主要促進(jìn)者，與神經(jīng)干細(xì)胞缺陷密切相關(guān)。但USP16基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本上是未知的。本研究主要探討核轉(zhuǎn)錄因子 NFκB對(duì)人USP16基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其分子機(jī)制。
　　方法：引物設(shè)計(jì)、質(zhì)粒構(gòu)建、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染、熒光素酶活性檢測(cè)及分析、

2、核蛋白和ChIP DNA提取、電泳遷移率分析、染色質(zhì)免疫共沉淀、細(xì)胞干預(yù)、實(shí)時(shí)定量PCR。
　　結(jié)果：1.成功擴(kuò)增 USP16基因啟動(dòng)子區(qū)-1856至+468共2324bp DNA序列，插入載體 pGL4.10構(gòu)建重組熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pUSP16-A，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建一系列刪切質(zhì)粒。并通過(guò)熒光素酶活性檢測(cè)得到了一系列正性和負(fù)性調(diào)控區(qū)域。
　　2.轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)人USP16基因啟動(dòng)子區(qū)-1856至+468含有若干核轉(zhuǎn)錄

3、因子結(jié)合位點(diǎn)，如：NFκB、HIF、SP1。
　　3.根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)結(jié)果顯示的結(jié)合位點(diǎn)，依次構(gòu)建4個(gè)重組熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pUSP16-N1～pUSP16-N4。在HEK293細(xì)胞中，與空載PMTF相比，共轉(zhuǎn)PMTF-p65質(zhì)粒后熒光素酶活性分別增加2.69，2.51，2.24和2.04倍（P＜0.001），并且對(duì)N1 vs. N3, N1 vs. N4以及 N2 vs. N4統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，結(jié)合位點(diǎn)2和3的缺失對(duì)NFκB在上調(diào)US

4、P16基因啟動(dòng)子中的作用有很大的影響。在SH-SY5Y細(xì)胞中，得到類(lèi)似的結(jié)果（P＜0.001）。
　　4.電泳遷移率分析，我們發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)到的結(jié)合位點(diǎn)2，3和4在體外可與NFκB p65結(jié)合；而染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，預(yù)測(cè)到的結(jié)合位點(diǎn)2和3可與NF?Bp65結(jié)合，而位點(diǎn)1和4不能結(jié)合。
　　6．LPS干預(yù)導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)源性USP16 mRNA水平顯著增加（1.58倍）（P＜0.05），但在HEK293細(xì)胞中無(wú)顯著影響

5、（數(shù)據(jù)未顯示）。然而，在HEK293細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞中，TNFa干預(yù)分別使內(nèi)源性USP16 mRNA的水平增加了1.90倍（P＜0.01）和1.85倍（P＜0.05）。
　　結(jié)論：人 USP16基因的5'側(cè)翼區(qū)，從-1856至+468，具有顯著啟動(dòng)子活性；過(guò)表達(dá)NFκB p65可以上調(diào)人USP16啟動(dòng)子活性；無(wú)論在體內(nèi)或體外，有兩個(gè)（-826～-815和-510～-501）NF?B p65結(jié)合位點(diǎn)與均可與USP16相互作用

6、；過(guò)表達(dá)NF?Bp65或LPS和TNFα的刺激活化NFκB均能上調(diào)人類(lèi)USP16基因的轉(zhuǎn)錄?？傊琋F?B可通過(guò)兩個(gè)真正的順式作用元件上調(diào)人USP16基因的轉(zhuǎn)錄。
　　第二部分棉鼠SP-A基因生物信息學(xué)分析及其與肺損傷相關(guān)性的研究
　　目的：分析棉鼠肺表面活性相關(guān)蛋白 A（SP-A）基因序列結(jié)構(gòu)和生物信息學(xué)特點(diǎn)，觀察棉鼠肺損傷模型中 SP-A mRNA和蛋白表達(dá)水平，初探SP-A表達(dá)規(guī)律與肺損傷的相關(guān)性。
　　方法：將

7、32只棉鼠隨機(jī)均分為4組:3個(gè)實(shí)驗(yàn)組棉鼠分別腹腔注射2 mg/kg LPS處理24、48和96 h，對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。建模后提取肺組織總RNA，經(jīng) RT-PCR擴(kuò)增 SP-A基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析；組織切片觀察LPS作用不同時(shí)期肺組織病理學(xué)變化；qRT-PCR分析SP-A mRNA水平；蛋白印跡法檢測(cè)SP-A蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：棉鼠SP-A基因編碼區(qū)長(zhǎng)744bp，編碼248個(gè)氨基酸，具有多個(gè)半胱氨酸保守位點(diǎn)、α

8、螺旋結(jié)構(gòu)和糖基化位點(diǎn)，與其他物種相比其核苷酸（75.4%～90.1%）和氨基酸（70.6%～87.1%）序列均具有較高同源性；在LPS誘導(dǎo)肺損傷模型中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組肺組織病理學(xué)改變隨LPS刺激時(shí)間延長(zhǎng)而加重，具有時(shí)間依賴(lài)性；SP-A mRNA和蛋白表達(dá)水平在LPS處理24h后開(kāi)始迅速增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001和P＜0.01），48h時(shí)仍持續(xù)上升（P＜0.001和P＜0.01），96h時(shí)略有下降，但仍保持在較高水平