豚鼠和家兔封閉群動(dòng)物DNA多態(tài)性檢測方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、封閉群動(dòng)物在遺傳組成上具有雜合性，被廣泛的用于藥學(xué)實(shí)驗(yàn)和生物制品的檢定等方面。但到目前為止，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳學(xué)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)主要是針對(duì)近交系動(dòng)物，而對(duì)封閉群動(dòng)物缺乏有效的遺傳檢測方法和控制標(biāo)準(zhǔn)，造成使用不同批次封閉群動(dòng)物的結(jié)果不一致的現(xiàn)象，影響動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和檢驗(yàn)工作。
　　封閉群豚鼠，因其具有特殊的生物學(xué)特性和生理解剖特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究中的各個(gè)領(lǐng)域，常用的有Hartley豚鼠。我國使用較多的實(shí)驗(yàn)兔有新西蘭白兔、日本大耳白兔和青紫

2、蘭兔等品種，也是遺傳背景復(fù)雜的封閉群動(dòng)物。由于缺乏有效的遺傳監(jiān)測，目前我國封閉群動(dòng)物主要在繁育環(huán)節(jié)上進(jìn)行遺傳質(zhì)量控制，使得其實(shí)際遺傳背景尚不清楚，嚴(yán)重制約了封閉群動(dòng)物的應(yīng)用，而遺傳監(jiān)測是保證和評(píng)價(jià)其遺傳質(zhì)量不可或缺的措施。本研究以群體遺傳學(xué)理論為依據(jù)，應(yīng)用篩選獲得的封閉群豚鼠多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記，建立了適用于封閉群豚鼠遺傳質(zhì)量檢測的微衛(wèi)星標(biāo)記檢測方法，并應(yīng)用該方法對(duì)2個(gè)豚鼠群體進(jìn)行遺傳質(zhì)量檢測；同時(shí)，應(yīng)用篩選獲得的封閉群兔SNP位點(diǎn)，建立了

3、適用于封閉群兔遺傳質(zhì)量檢測的SNP遺傳檢測方法，并用該方法分析了3個(gè)封閉群兔的遺傳多樣性。為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量控制提供新的遺傳檢測手段。
　　本研究分為兩部分：
　　一、封閉群豚鼠微衛(wèi)星標(biāo)記檢測方法的建立及初步應(yīng)用
　　首先，通過比較新鮮抗凝血NaI手提法、血凝塊手提法和試劑盒DNA提取法三種血液基因組DNA提取方法，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供簡便、快捷的DNA提取方法。其次，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)挑選出40個(gè)富含多態(tài)性的豚鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)，經(jīng)

4、過PCR條件優(yōu)化、3％瓊脂糖凝膠電泳和STR掃描篩選共獲得25個(gè)擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高的微衛(wèi)星位點(diǎn)。再有，采用篩選出的25個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)，建立封閉群豚鼠微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳質(zhì)量檢測方法，對(duì)A、B兩個(gè)封閉群豚鼠進(jìn)行遺傳質(zhì)量檢測，并計(jì)算其群體遺傳學(xué)參數(shù)，包括平均觀測等位基因數(shù)、平均期望雜合度、平均多態(tài)信息含量等，然后進(jìn)行了Hardy-Weinberg平衡（HWE）檢驗(yàn)和雜合子缺失檢驗(yàn)。群體統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示：A群和B群的平均觀察等位基因數(shù)分別

5、為4.12和4.64；平均有效等位基因數(shù)分別為2.4232和2.7947；平均觀察雜合度分別為0.4467和0.5062；平均期望雜合度分別為0.5195和0.5838；平均多態(tài)信息含量分別為0.459和0.518；Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)顯示，兩個(gè)群體分別有5個(gè)位點(diǎn)和6個(gè)位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg平衡（P<0.05）；雜合子缺失檢驗(yàn)表明，兩群體偏離遺傳平衡的大多數(shù)位點(diǎn)表現(xiàn)出顯著的雜合子缺陷（P<0.05）；不

6、同微衛(wèi)星位點(diǎn)群體間的平均 Fst值為0.1056，即群體間的遺傳變異占總遺傳變異的10.56%，遺傳分化程度為中等；兩群體的Nei’s(1972)遺傳距離和Nei’s(1978)無偏遺傳距離分別為0.3302和0.3204。B群豚鼠遺傳多樣性略高于A群。
　　二、封閉群兔SNP遺傳檢測方法的建立及初步應(yīng)用
　　建立封閉群兔SNP直接測序分型遺傳檢測方法，選取多態(tài)性豐富的區(qū)域設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)直接測序后進(jìn)行序列比對(duì)，共獲得9

7、個(gè)家兔多態(tài)性SNP位點(diǎn)；同時(shí)，建立封閉群兔高保真酶特異性SNP遺傳檢測方法，將高保真酶的原理與單管雙向等位基因特異性擴(kuò)增相結(jié)合，并引入硫代磷酸化修飾引物的抗外切酶作用，經(jīng)篩選共獲得20個(gè)穩(wěn)定擴(kuò)增、條帶清晰的SNP位點(diǎn)，其中7個(gè)為多態(tài)性SNP位點(diǎn)。應(yīng)用兩種方法獲得的29個(gè)SNP位點(diǎn)分析日本大耳白兔、新西蘭白兔、青紫藍(lán)兔的遺傳質(zhì)量。選用平均有效雜合度、平均多態(tài)信息含量、平均Shannon信息指數(shù)等指標(biāo)對(duì)3個(gè)群體進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：三個(gè)群體

8、的平均有效雜合度分別是0.1453、0.1696和0.1731，平均多態(tài)信息含量分別為0.1152、0.1313和0.1354，平均Shannon信息指數(shù)分別為0.2157、0.2451、0.2531。3個(gè)群體的變異程度青紫藍(lán)兔>新西蘭白兔>日本大耳白兔，該結(jié)果與以往報(bào)道的微衛(wèi)星方法對(duì)3個(gè)群體的分析結(jié)果一致，但各項(xiàng)群體變異參數(shù)均小于微衛(wèi)星標(biāo)記的檢測結(jié)果。
　　總之，本研究通過比較最終選擇新鮮抗凝血NaI手提法提取血液基因組DNA；

9、建立了豚鼠微衛(wèi)星DNA遺傳質(zhì)量檢測方法，該方法對(duì)2個(gè)豚鼠封閉群的檢測結(jié)果顯示2個(gè)種群都符合封閉群動(dòng)物的群體遺傳特征，但個(gè)別偏離遺傳平衡的位點(diǎn)，推測在飼養(yǎng)繁育過程中存在一定程度的近交現(xiàn)象；利用直接測序技術(shù)和高保真酶特異性檢測技術(shù)，建立家兔SNP遺傳質(zhì)量檢測方法，利用該方法對(duì)3個(gè)家兔封閉群進(jìn)行遺傳分析，其結(jié)果與以往報(bào)道的微衛(wèi)星檢測結(jié)果一致，驗(yàn)證了建立的SNP方法的有效性。這些研究為封閉群豚鼠和家兔遺傳檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)的建立提供基礎(chǔ)，對(duì)提高我國