負(fù)載吲哚菁綠的介孔硅納米探針在肝癌術(shù)中精準(zhǔn)導(dǎo)航方法的研究.pdf

1、目前的肝臟腫瘤治療方法主要有(1)手術(shù)治療;(2)肝臟移植;(3)化學(xué)藥物治療;(4)消融療法;(5)中醫(yī)中藥治療以及以上方法的聯(lián)合治療。目前手術(shù)治療被認(rèn)為是首選的最有可能治愈肝癌的方法。如果我們通過(guò)手術(shù)能把整個(gè)實(shí)體瘤完全切除，那么腫瘤患者是可以治愈的。仍需要投入大量的科研來(lái)尋找更多的能夠用于近紅外熒光手術(shù)導(dǎo)航儀的熒光分子探針。
　　在本實(shí)驗(yàn)研究中，我們針對(duì)近紅外熒光手術(shù)導(dǎo)航下，手術(shù)切除肝臟腫瘤研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，利用具有良好生物相容

2、性的多介孔二氧化硅(mesoporous silicalnanoparticals，MSNs)硅球材料作為分子探針的載體，用ICG作為近紅外熒光染料，并用RGD多肽進(jìn)行靶向修飾后構(gòu)建成能夠主動(dòng)靶向整合素αvβ3受體的近紅外熒光探針，并建立人肝癌皮下腫瘤裸鼠模型、人肝癌原位腫瘤裸鼠模型和人乳腺癌轉(zhuǎn)移性肝癌裸鼠模型，探討靶向探針的生物適應(yīng)性，主動(dòng)靶向性，靶向成像效果和術(shù)中實(shí)時(shí)熒光手術(shù)導(dǎo)航的應(yīng)用價(jià)值。
　　研究目的:
　　本研究的

3、目的是制備一種主動(dòng)靶向整合素αvβ3受體的近紅外熒光納米探針，可以在術(shù)中實(shí)時(shí)的精確定位肝臟腫瘤的位置和邊界，為術(shù)者在術(shù)中實(shí)時(shí)提供客觀的手術(shù)切緣參考，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的熒光手術(shù)導(dǎo)航切下切除腫瘤。
　　研究方法:
　　1.多介孔硅球的合成和觀察
　　水熱合成法合成多介孔硅球，掃描電鏡和透射電鏡觀察多介孔硅球的形貌和大小;粒度儀檢測(cè)多介孔硅球的水合粒徑與粒徑分布特征。
　　2.主動(dòng)靶向探針的合成與化學(xué)表征
　　將吲哚菁綠

4、超聲震蕩上載入多介孔硅球中，聚乙二醇修飾后，加入RGD多肽溶液制備成主動(dòng)靶向αvβ3受體的近紅外熒光納米探針(ICG/MSNs-RGD)。掃描電鏡和透射電鏡觀察靶向探針的形貌和大小，粒度儀檢測(cè)探針?biāo)狭脚c分布;熒光分光光度計(jì)檢測(cè)靶向探針及ICG的發(fā)射光譜與激發(fā)光譜。
　　3.探針毒性實(shí)驗(yàn)、體外靶向探針靶向能力的觀察
　　用MSNs和靶向探針(ICG/MSNs-RGD)孵育HepG2肝癌細(xì)胞后，再用MTT法評(píng)估MSNs和靶向

5、探針的毒性;將αvβ3受體高表達(dá)的MDA-MB-231-GFP乳腺癌細(xì)胞和αvβ3受體低表達(dá)的MCF-7乳腺癌細(xì)胞分別用靶向探針(ICG/MSNs-RGD)孵育1小時(shí)，用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer solution，PBS)液沖洗干凈后，近紅外體式熒光顯微鏡觀察兩種細(xì)胞攝取靶向探針的情況;
　　4.皮下肝臟腫瘤裸鼠模型，原位肝臟腫瘤裸鼠模型和乳腺癌肝轉(zhuǎn)移癌裸鼠模型的建立
　　取20只5-6周雄性BALB/

6、c裸鼠，取含1×107/mL HepG2-GFP細(xì)胞懸液接種于裸鼠左腋部皮下，建立裸鼠皮下肝臟腫瘤裸鼠模型。
　　在無(wú)菌條件下麻醉裸鼠，經(jīng)劍突下5mm處豎直切口開(kāi)腹部暴露肝臟，沿肝臟被膜下進(jìn)針，緩慢推入50μL含1×107/mL HepG2-GFP或MDA-MB-231-GFP細(xì)胞懸液，逐層關(guān)腹，同樣方法建立10只5-6周雄性BALB/c裸鼠原位模型或10只5-6周雌性BALB/c乳腺癌肝臟轉(zhuǎn)移裸鼠模型。
　　5.在體研究靶

7、向探針的主動(dòng)靶向功能
　　取8只皮下肝臟腫瘤裸鼠模型，隨機(jī)分成兩組（每組4只），一組為對(duì)照組，經(jīng)尾靜脈注射非靶向探針(ICG/MSNs)150μL(0.2 mg/mL);一組為靶向探針組，經(jīng)尾靜脈注射靶向探針(ICG/MSNs-RGD)150μL（0.2 mg/mL）。在注射后，的10min，12h，24h，48h，72h，96h和120h用IVIS200分子影像系統(tǒng)觀察探針在體分布情況。其中，在24h時(shí)，每組分別取一只荷瘤裸鼠，

8、脫頸處死，取腫瘤，心臟，肝臟，脾臟，腎臟等重要臟器，觀察探針在各重要臟器的分布情況。同時(shí)用IVIS活體成像軟件3.0分析腫瘤區(qū)域探針代謝數(shù)據(jù)并繪制曲線(xiàn)。
　　6.探針在皮下肝腫瘤邊界的精準(zhǔn)定位的應(yīng)用
　　取3只皮下肝臟腫瘤裸鼠模型，經(jīng)尾靜脈注射靶向探針(ICG/MSNs-RGD，150μL，0.2 mg/mL)48h后，用近紅外體式熒光顯微鏡系統(tǒng)進(jìn)行熒光手術(shù)導(dǎo)航定位腫瘤位置和邊界，同時(shí)用腫瘤自帶綠色熒光作為定位腫瘤位置和邊界

9、的參考標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)后將腫瘤標(biāo)本切片后行HE染色，在病理切片水平，用近紅外體式熒光顯微鏡系統(tǒng)定位腫瘤邊界與HE染色結(jié)果對(duì)比，確定近紅外熒光導(dǎo)航系統(tǒng)在宏觀和微觀上均可以精準(zhǔn)的定位腫瘤邊界。
　　7.探針對(duì)于微小皮下肝臟腫瘤的手術(shù)導(dǎo)航的應(yīng)用
　　取12只皮下肝臟腫瘤裸鼠模型，經(jīng)尾靜脈注射靶向探針(ICG/MSNs-RGD，150μL，0.2 mg/mL)48h后，分成兩組，每組6只，兩位臨床醫(yī)師在遵循最大限度的切除腫瘤的同時(shí)盡最大努力

10、保留正常組織的條件下，分別對(duì)6只荷瘤裸鼠進(jìn)行腫瘤切除，醫(yī)師在憑借視診、觸診的主觀判斷腫瘤已經(jīng)切除完全后，用近紅外熒光體式熒光顯微鏡系統(tǒng)對(duì)手術(shù)區(qū)域進(jìn)行檢查，評(píng)估是否仍有微小腫瘤的殘余。如果有微小腫瘤的殘余，在近紅外熒光體式熒光顯微鏡系統(tǒng)輔助下繼續(xù)進(jìn)行腫瘤切除，直到腫瘤切除干凈。最后所有腫瘤標(biāo)本均進(jìn)行病理切片觀察。
　　8.探針對(duì)于肝臟微小原位轉(zhuǎn)移灶的精確診斷及手術(shù)導(dǎo)航切除
　　取原位肝癌裸鼠模型小鼠3只，經(jīng)尾靜脈注射靶向探針（

11、ICG/MSNs-RGD，150μL，0.2 mg/mL）48h后，將小鼠麻醉，經(jīng)腹正中線(xiàn)開(kāi)腹暴露肝臟，在近紅外熒光手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)導(dǎo)航下，輔助術(shù)者定位肝臟腫瘤位置和腫瘤邊界，完成肝臟原位腫瘤的手術(shù)切除，然后再行腹腔探查。
　　9.探針對(duì)于肝臟轉(zhuǎn)移癌及腹腔轉(zhuǎn)移癌的診斷及手術(shù)導(dǎo)航切除
　　取乳腺癌肝臟轉(zhuǎn)移裸鼠模型3只，經(jīng)尾靜脈注射靶向探針(ICG/MSNs-RGD，150μL，0.2 mg/mL)48h后，將小鼠麻醉，經(jīng)腹正中線(xiàn)開(kāi)

12、腹暴露肝臟，在近紅外熒光手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)導(dǎo)航下，輔助術(shù)者定位肝臟轉(zhuǎn)移癌位置和邊界，完成肝臟轉(zhuǎn)移癌的手術(shù)切除，然后再行腹腔探查。
　　10.組織病理驗(yàn)證
　　將腫瘤組織利用冰凍切片包埋劑（optimum cutting temperature OCT）進(jìn)行包埋和連續(xù)切片，然后將組織切片用蘇木素和伊紅(H&E)染色法進(jìn)行染色固定。
　　11.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　連續(xù)變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組組間整體比較

13、采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析;單因素組內(nèi)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析;單個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較應(yīng)用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)分析應(yīng)用IBM SPSS19.0軟件進(jìn)行分析， P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，繪圖及表格軟件應(yīng)用Prim5.0.
　　研究結(jié)果:
　　1.介孔硅球呈規(guī)則的球形，粒徑約為100nm，分散性良好。靶向探針I(yè)CG/MSNs-RGD保持規(guī)格的球形，粒徑約為100nm，分散性良好;激發(fā)波長(zhǎng)(780nm)和發(fā)射波長(zhǎng)(8

14、37nm);與ICG相比，發(fā)生了3-4nm的紅移。
　　2.MTT毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MSNs和靶向探針I(yè)CG/MSNs-RGD具有良好的生物相容性;體外靶向探針特異性評(píng)估實(shí)驗(yàn)中，在近紅外體式熒光顯微鏡觀察到探針I(yè)CG/MSNs-RGD孵育后的αvβ3受體高表達(dá)的MDA-MB-231-GFP乳腺癌細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度比αvβ3受體低表達(dá)的MCF-7乳腺癌細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)，MDA-MB-231-GFP細(xì)胞攝取了更多的探針I(yè)CG/MSNs-RGD。

15、r>　　3.在體靶向探針代謝實(shí)驗(yàn)中，探針組皮下荷瘤裸鼠在注射探針10min，12h，24h，48h，72h，96h和120h后，腫瘤區(qū)域的熒光值隨著時(shí)間的推移逐漸消退，腫瘤區(qū)域與周?chē)＝M織的熒光強(qiáng)度對(duì)比值在48h時(shí)最大（4.92±0.2），可以選擇為最佳手術(shù)時(shí)間點(diǎn)。在離體腫瘤和器官水平上，可見(jiàn)探針主要分布在腫瘤區(qū)域。
　　4.靶向探針在術(shù)中可以給術(shù)者提供清晰的腫瘤位置和腫瘤邊界，為術(shù)者提供一個(gè)客觀的腫瘤邊界參考。
　　5.

16、在探針對(duì)于微小皮下肝臟腫瘤的手術(shù)導(dǎo)航的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)中，兩位手術(shù)醫(yī)師都可以定位和切除直徑為5.01±2.08 mm的大腫瘤。通過(guò)近紅外體式熒光顯微鏡的輔助，兩位醫(yī)師分別發(fā)現(xiàn)肉眼無(wú)法發(fā)現(xiàn)的微小殘余癌癥2個(gè)和3個(gè)，直徑在0.95±0.07 mm。切除的總共腫瘤數(shù)目為17個(gè)，HE染色確定均為腫瘤組織。
　　6.在探針對(duì)于原位肝癌裸鼠模型的實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)尾靜脈注射靶向探針48h后，經(jīng)腹正中線(xiàn)開(kāi)腹暴露肝臟，并用近紅外體式熒光導(dǎo)航系統(tǒng)輔助術(shù)者切除腫瘤，

17、5.09±2.31 mm大小的腫瘤肉眼均能判斷，但是0.4±0.21 mm微小轉(zhuǎn)移灶通過(guò)導(dǎo)航系統(tǒng)能夠判斷，與周?chē)＝M織的對(duì)比度(Tumor to background，TBR)為4.7±0.21。在應(yīng)用近紅外體式熒光導(dǎo)航系統(tǒng)對(duì)腹腔進(jìn)行探測(cè)，發(fā)現(xiàn)肉眼未能發(fā)現(xiàn)的微小癌灶有5個(gè)，大小約為1mm，腫瘤區(qū)域與正常組織的對(duì)比度為T(mén)BR=5.23±0.82。
　　7.同樣，在乳腺癌肝臟轉(zhuǎn)移模型中，經(jīng)尾靜脈注射靶向探針48h后，經(jīng)腹正中線(xiàn)開(kāi)腹暴

18、露肝臟，并用近紅外體式熒光導(dǎo)航系統(tǒng)輔助術(shù)者切除腫瘤，對(duì)于乳腺癌肝轉(zhuǎn)移的腫瘤模型，探針在整個(gè)腫瘤內(nèi)積聚。提供給術(shù)者一個(gè)清晰的腫瘤定位和腫瘤邊界。
　　研究結(jié)論:
　　合成的主動(dòng)靶向整合素αvβ3受體的近紅外熒光探針，具有良好的生物適應(yīng)性，對(duì)整合素αvβ3受體具有良好的特異靶向性;在手術(shù)過(guò)程中實(shí)時(shí)的輔助術(shù)者精準(zhǔn)定位腫瘤位置和邊界，同時(shí)提供良好的信背比。輔助術(shù)者在手術(shù)中準(zhǔn)確定位腫瘤邊界和實(shí)時(shí)的定位亞毫米微小腫瘤（原位腫瘤或轉(zhuǎn)移腫瘤