感覺神經(jīng)化促大段骨缺損成骨作用機制的研究.pdf

1、背景：
　　如何更有效的治療大段骨缺損歷來是骨科工作者挑戰(zhàn)的一個難題[1]。采用自體骨移植的方法雖然效果好，但是由于骨量的限制，大多數(shù)病人無法實現(xiàn)[2，3]。而應用同種異體骨進行移植，因為有強烈的免疫反應，恢復的往往很差[4]。隨著材料學的發(fā)展，人工骨移植的使用逐漸增多，而這個方法成骨效果差，臨床應用仍未取得好的進展。近幾年來，隨著組織工程骨的出現(xiàn)，為大段骨缺損的治療提供了理想的手段[5,6]。
　　然而，雖然相對于一般的人

2、工骨移植，組織工程骨的成骨作用相對較好，但仍未達到期待的水平。近幾年來對于提高組織工程骨成骨效果的研究十分火熱，主要方向集中在血液的供給與神經(jīng)的支配兩個方面。良好的血供可以給組織工程骨提供氧氣與營養(yǎng)，以及一些成骨促成因子，所以血管化有助于骨的生長與再生，這已經(jīng)得到了業(yè)界的廣泛認可[7]。但神經(jīng)支配對于組織工程骨成骨的作用機制卻并不是很清楚，它需要我們進一步的研究。
　　有研究發(fā)現(xiàn)，感覺神經(jīng)化可以促進組織工程骨成骨，其成骨效果與血管

3、化相似，而運動神經(jīng)化卻沒有效果[8]。這個研究結果表明這兩類神經(jīng)對于組織工程骨的成骨效果是不一樣的。本研究則是基于這一研究結果，通過制作大鼠大段骨缺損模型，用小動物驗證了感覺神經(jīng)化能促進大段骨缺損修復這一結論；再通過細胞實驗，來探討分子機制；最后通過對比感覺神經(jīng)與運動神經(jīng)的不同，篩選出差異蛋白，為進一步的研究提供新的方向。
　　目的：
　　探討感覺神經(jīng)化促進大鼠股骨大段骨缺損修復的機制，為大段骨缺損治療提供新方法。
　

4、　方法：
　　第一部分：感覺神經(jīng)化大鼠大段骨缺損模型的制作與修復效果的觀察
　　采用成年SD大鼠作為實驗動物，在組織工程骨材料上敷上GFP+的BMSCs作為種子細胞，然后分別制作大段骨缺損空白組、組織工程骨植入組和感覺神經(jīng)移植組動物模型。分別在1周、4周、8周手術獲取大鼠實驗肢股骨，拍攝X光片和Micro-CT，觀察成骨效果。固定、去除鈣鹽后切片，行HE和共聚焦染色，顯微鏡下拍攝圖片，探究其組織學變化。
　　第二部分：

5、不同濃度兩種神經(jīng)勻漿對大鼠BMSCs的影響
　　用顯微外科手術的方法提取大鼠隱神經(jīng)與坐骨神經(jīng)肌支分別作為感覺神經(jīng)與運動神經(jīng)組織。按每10 mg神經(jīng)加入1 mL成骨誘導液，首先制備10 mg/mL的神經(jīng)勻漿。過濾提純后10倍稀釋，制備出從高到低5種不同濃度梯度的神經(jīng)勻漿提取液，－80℃凍存?zhèn)溆?。體外培養(yǎng)GFP+大鼠幼鼠BMSCs，常規(guī)培養(yǎng)至第3代后分別加入以上5種濃度梯度的感覺神經(jīng)勻漿與、運動神經(jīng)勻漿作用，14 d后行CCK-8檢測

6、與ALP染色，觀察BMSCs的增殖與分化情況。
　　第三部分：共培養(yǎng)狀態(tài)下DRG對BMSCs的影響
　　混合共培養(yǎng)實驗：取SD大鼠新生鼠DRG，與GFP+BMSCs混合共培養(yǎng)，觀察細胞的生長狀態(tài)與變化。
　　隔離共培養(yǎng)實驗：取SD大鼠新生鼠DRG，消化后按1×103個細胞/Transwell小室的比例，接種感覺神經(jīng)元細胞，每個Transwell接六個DRG，再將其放入六孔板中，作為實驗組；對照組六孔板中只加入BMSCs

7、，放入未添加DRG的Transwell小室。由于細胞自帶綠色熒光，可以隨時觀察細胞的生長變化，10d后進行CCK-8檢測，成骨相關抗體染色，拍攝共聚焦圖片。
　　第四部分：iTRAQ技術篩選小鼠感覺神經(jīng)、運動神經(jīng)的差異蛋白
　　取300只昆明小鼠的坐骨神經(jīng)肌支作為運動神經(jīng)，隱神經(jīng)作為感覺神經(jīng)，各分為兩組，劃分成四組，感覺神經(jīng)組記為Y1、Y2，運動神經(jīng)組記為Z1、Z2。而后兩兩比較，找出兩種不同神經(jīng)的差異。
　　結果：<

8、br>　　第一部分：感覺神經(jīng)移植組的成骨效果優(yōu)于空白組，新生骨數(shù)量增加，并且種子細胞的存活與增殖數(shù)量均顯著多于對照組。
　　第二部分：CCK-8結果顯示：濃度位于0.1～1.0 mg/mL的感覺神經(jīng)勻漿提取液促進BMSCs增殖的作用最明顯（P＜0.05）；濃度為10 mg/mL的運動神經(jīng)勻漿提取液對BMSCs增殖的抑制作用明顯（P＜0.05）；ALP染色結果顯示：兩個勻漿添加組的著色結晶數(shù)量都遠遠少于未添加組（P＜0.05）。

9、r>　　第三部分：混合共培養(yǎng)實驗中BMSCs細胞有向感覺神經(jīng)元遷移、富集的現(xiàn)象發(fā)生；隔離共培養(yǎng)實驗中，加入DRG共培養(yǎng)的組BMSCs的量顯著高于未添加組（P＜0.05）。BMSCs成骨方向變化的能力加DRG組培養(yǎng)組明顯小于未加組。
　　第四部分：通過計算機對比測定，得到差異蛋白1667種。
　　結論：
　　感覺神經(jīng)化有促進組織工程骨成骨的效果。其作用原理可能在于感覺神經(jīng)能夠提高 BMSCs增殖的能力，并影響其成骨方向轉