組蛋白去乙?；?及白介素17A在慢阻肺及哮喘中的分子機(jī)制研究.pdf

1、慢性阻塞性肺疾病（簡(jiǎn)稱(chēng)慢阻肺）和支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘）是最常見(jiàn)的慢性氣道炎癥性疾病。WHO最新數(shù)據(jù)顯示，全球慢阻肺患者已超過(guò)2.3億，且病死率逐年上升，預(yù)計(jì)到2020年慢阻肺將成為全球第三大死因。目前，中國(guó)約有4.5千萬(wàn)慢阻肺患者，慢阻肺已經(jīng)成為中國(guó)城市第四大死因、中國(guó)農(nóng)村第一大死因。目前，全世界約有3億哮喘病人，中國(guó)約有3千萬(wàn)哮喘患者，是全球哮喘病死率最高的國(guó)家之一。慢阻肺和哮喘嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給患者及家庭、社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)

2、負(fù)擔(dān)。因此，研究慢阻肺及哮喘的發(fā)病機(jī)制及有效治療方法的研究顯得非常緊迫。
　　慢阻肺是一種可防可治的慢性氣道炎癥性疾病，疾病發(fā)展過(guò)程伴有不完全可逆的氣流受限。吸煙是慢阻肺最主要的誘發(fā)因素，但其發(fā)病機(jī)制目前仍未闡明。慢阻肺氣道炎癥主要為T(mén)h1及TC1型免疫反應(yīng)，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及CD8+T細(xì)胞增多，并有粘液高分泌和纖毛粘液清除功能減弱。越來(lái)越多的證據(jù)表明，慢阻肺的發(fā)病過(guò)程與氣道的免疫反應(yīng)緊密相關(guān)。大量研究表明慢阻肺患者對(duì)激素治

3、療不敏感，吸入激素對(duì)炎癥細(xì)胞的數(shù)量以及前炎癥介質(zhì)的釋放均無(wú)影響。目前對(duì)慢阻肺仍缺乏有效的防治手段。一般認(rèn)為哮喘的發(fā)病機(jī)制主要涉及Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡，它是一種以嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞參與，氣道粘液高分泌、氣道高反應(yīng)性和氣道重構(gòu)為特征的氣道慢性炎癥性疾病。吸入糖皮質(zhì)激素是目前治療哮喘最有效的方法之一，對(duì)激素敏感的哮喘病人大多存在嗜酸粒細(xì)胞性氣道炎癥。但有研究表明，部分哮喘患者存在中性粒細(xì)胞性氣道炎癥反應(yīng)，而這些

4、患者大多為重癥哮喘。臨床上發(fā)現(xiàn)這些重癥哮喘患者對(duì)糖皮質(zhì)激素治療不敏感，表現(xiàn)為激素低效或者激素抵抗。其炎癥特征不同于輕度哮喘，而與慢阻肺相似。臨床研究發(fā)現(xiàn)，慢阻肺和重癥哮喘患者中組蛋白去乙?；?(HDAC2)的表達(dá)水平和活性均顯著降低，并可能是導(dǎo)致這些慢性氣道炎癥患者激素不敏感的重要因素。新近研究表明，以中性粒細(xì)胞反應(yīng)為主的慢性氣道炎癥與Th17密切相關(guān)。Th17細(xì)胞是一類(lèi)能分泌IL-17A-F以及IL-22等細(xì)胞因子的新型效應(yīng)CD4+

5、T細(xì)胞亞群。臨床研究發(fā)現(xiàn)，IL-17A的表達(dá)水平與哮喘病人的病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，重度哮喘患者血清中IL-17A表達(dá)水平較輕、中度患者明顯增高，激素抵抗的重癥哮喘患者IL-17A的水平與氣道中性粒細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。Th17相關(guān)的炎癥因子在慢阻肺患者的氣道粘液中表達(dá)水平增高。這些研究表明，Th17細(xì)胞在中性粒細(xì)胞性氣道炎癥的分子發(fā)病機(jī)制中起重要作用。Th17早期分化依賴(lài)于IL-1信號(hào)途徑與IL-6等的聯(lián)合作用，而在慢性氣道炎癥中，這些炎癥

6、因子的產(chǎn)生可能與HDAC2有關(guān)。HDAC與組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶(HAT)兩者之間的動(dòng)態(tài)平衡控制著組蛋白的乙?；胶腿旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，從分子轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控各種炎癥基因的表達(dá)，從而在慢性氣道炎癥中起重要作用。HDAC2活性下降增加了組蛋白的乙?；?，從而導(dǎo)致NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子活性增加，相關(guān)炎癥因子包括IL-6以及pro-IL-1β等表達(dá)增高。據(jù)此我們假設(shè)，HDAC2與IL-17A之間可能存在相互調(diào)控作用，HDAC2調(diào)控IL-1β和IL-6等炎

7、癥因子產(chǎn)生，繼而調(diào)控Th17的分化和中性粒細(xì)胞性氣道炎癥反應(yīng)，從而在慢阻肺和重癥哮喘的分子發(fā)病過(guò)程中起關(guān)鍵作用。
　　本課題通過(guò)收集慢阻肺及哮喘患者的臨床標(biāo)本，利用HDAC2、IL-17A基因敲除小鼠構(gòu)建慢阻肺及哮喘模型，體外利用人氣道上皮細(xì)胞，分離培養(yǎng)原代人及小鼠肺成纖維細(xì)胞等方法，研究HDAC2及IL-17A相互調(diào)控作用在慢阻肺氣道重構(gòu)及哮喘氣道炎癥中的機(jī)制。
　　第一部分 HDAC2抑制IL-17A介導(dǎo)的慢阻肺氣道重構(gòu)

8、的機(jī)制研究
　　背景及目的:
　　氣道重構(gòu)是慢阻肺發(fā)病機(jī)制的主要特征之一，目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。該部分通過(guò)收集臨床標(biāo)本（如誘導(dǎo)痰、肺組織），利用轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建熏煙煙霧誘導(dǎo)的慢阻肺模型，體外利用人氣道上皮細(xì)胞，分離培養(yǎng)原代人及小鼠肺成纖維細(xì)胞，探討HDAC2能否通過(guò)調(diào)控IL-17A表達(dá)緩解慢阻肺氣道重構(gòu)及其相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　收集正常健康人及慢阻肺患者的臨床資料、肺功能、誘導(dǎo)痰及高分辨率CT(HRCT

9、)評(píng)估支氣管壁厚度。用ELISA及免疫組化檢測(cè)誘導(dǎo)痰HDAC2及IL-17A表達(dá)。收集慢阻肺合并肺癌患者手術(shù)的切除癌旁正常肺組織，用免疫組化及Masson三色染色法分析肺組織HDAC2、 IL-17A及膠原表達(dá)。利用Spearman分析HDAC2、IL-17A與氣道重構(gòu)（氣管壁厚度及膠原沉積）的相關(guān)性。同時(shí)，利用HDAC2、IL-17A基因敲除小鼠（HDAC2+/-，IL-17A-/-）及HDAC2/IL-17A雙基因敲除小鼠（HDAC

10、2+/-/IL-17A-/-）構(gòu)建煙霧暴露誘導(dǎo)慢阻肺模型（100支煙/天，5天/周，連續(xù)3個(gè)月）。取右肺保存在-80℃，用于提取蛋白和mRNA，用ELISA和RT-PCR法檢測(cè)相關(guān)炎癥因子的表達(dá)。取左肺支氣管肺泡灌洗液(BALF)，進(jìn)行炎癥細(xì)胞總數(shù)與分類(lèi)計(jì)數(shù)。肺組織經(jīng)4％多聚甲醛固定后，制成病理切片蘇木精-伊紅染色法(HE)觀察炎癥浸潤(rùn)。用過(guò)碘酸希夫反應(yīng)(PAS)、Masson三色染及免疫組化觀察氣道重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)包括粘液分泌、膠原沉積及

11、氣道平滑肌。分析肺組織HDAC2及IL-17A表達(dá)與氣道重構(gòu)的相關(guān)性。另一部分小鼠的雙肺，剪碎后經(jīng)膠原酶消化，研磨制成細(xì)胞懸液，經(jīng)過(guò)刺激后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺組織中HDAC2及IL-17A及各個(gè)T細(xì)胞亞型的變化。培養(yǎng)人支氣管上皮(HBE)細(xì)胞并予香煙提取物(CSE)、HDAC2小干擾(HDAC2 SiRNA)轉(zhuǎn)染干預(yù)，利用免疫熒光及RT-PCR檢測(cè)IL-17A表達(dá)水平。取手術(shù)切除的肺組織及小鼠肺組織，分離及培養(yǎng)原代肺成纖維細(xì)胞，觀察IL-

12、17A對(duì)成纖維細(xì)胞增殖、遷移、膠原沉積及分化的影響。
　　結(jié)果:
　　Spearman相關(guān)性分析顯示慢阻肺患者誘導(dǎo)痰HDAC2和IL-17A表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，且與支氣管壁增厚相關(guān)。慢阻肺患者肺組織中IL-17A表達(dá)與肺組織膠原沉積相關(guān)。香煙煙霧暴露后的HDAC2+/-小鼠的氣道炎癥浸潤(rùn)、炎癥因子表達(dá)及氣道重構(gòu)明顯增加，而IL-17A-/-小鼠的氣道炎癥浸潤(rùn)、炎癥因子表達(dá)及氣道重構(gòu)明顯緩解。HDAC2通過(guò)調(diào)控Th17細(xì)胞向CD4+

13、T細(xì)胞分化及氣道上皮細(xì)胞的維甲酸相關(guān)孤兒受體γt(RORγt)表達(dá)抑制IL-17A產(chǎn)生。在體外，IL-17A通過(guò)自分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞增殖、遷移、分化及膠原沉積，參與了氣道重構(gòu)。有趣的是，在HDAC2+/-小鼠中敲除IL-17A基因（即HDAC2+/-/IL-17A-/-小鼠）可以通過(guò)抑制氣道炎癥反應(yīng)及成纖維細(xì)胞活性緩解氣道重構(gòu)。
　　結(jié)論:
　　HDAC2通過(guò)抑制氣道炎癥及成纖維細(xì)胞活性緩解

14、IL-17A介導(dǎo)的氣道重構(gòu)，提示HDAC2-IL17A信號(hào)通路在慢阻肺氣道重構(gòu)起著重要作用，激活HDAC2和/或抑制IL-17A表達(dá)可能對(duì)緩解慢阻肺患者氣道重構(gòu)有效。
　　第二部分 HDAC2與IL-17A相互調(diào)控哮喘氣道炎癥的分子機(jī)制研究
　　背景及目的:
　　HDAC2表達(dá)下降與哮喘的疾病嚴(yán)重程度相關(guān);然而，導(dǎo)致HDAC2表達(dá)下降的原因及其如何調(diào)控氣道炎癥仍然不清楚。另外，IL-17A是否參與了HDAC2表達(dá)下降導(dǎo)

15、致的哮喘加重亦不清楚。
　　方法:
　　收集哮喘患者纖支鏡活檢標(biāo)本。用免疫組化檢測(cè)活檢標(biāo)本中HDAC2及IL-17A的表達(dá)，分析HDAC2與IL-17A表達(dá)的相關(guān)性。同時(shí)，利用HDAC2、IL-17A基因敲除小鼠（HDAC2+/-，IL-17A-/-）及HDAC2/IL-17A雙基因敲除小鼠(HDAC2+/-/IL-17A-/-)構(gòu)建屋塵螨(HDM)誘導(dǎo)的哮喘模型。取右肺保存在-80℃，用于提取蛋白和mRNA，用ELISA和

16、RT-PCR法檢測(cè)相關(guān)炎癥因子的表達(dá)。取左肺支氣管肺泡灌洗液(BALF)，進(jìn)行炎癥細(xì)胞總數(shù)與分類(lèi)計(jì)數(shù)。肺組織經(jīng)4％多聚甲醛固定后，制成病理切片蘇木精-伊紅染色法(HE)觀察炎癥浸潤(rùn)。用過(guò)碘酸希夫反應(yīng)(PAS)觀察粘液分泌。另一部分小鼠的雙肺，剪碎后經(jīng)膠原酶消化，研磨制成細(xì)胞懸液，經(jīng)過(guò)刺激后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺組織中HDAC2及IL-17A及各個(gè)T細(xì)胞亞型的變化。培養(yǎng)人支氣管上皮(HBE)細(xì)胞并予HDM、IL-17A細(xì)胞因子、HDAC2小干

17、擾轉(zhuǎn)染干預(yù)，利用免疫熒光及RT-PCR檢測(cè)炎癥因子表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　HDAC2在哮喘患者及小鼠肺組織中表達(dá)下降，而IL-17A表達(dá)水平明顯增加，且HDAC2與IL-17A呈負(fù)相關(guān)。HMD能導(dǎo)致小鼠肺組織及HBE細(xì)胞中HDAC2表達(dá)下降，而IL-17A表達(dá)增加。與野生型(WT)哮喘小鼠相比，HDAC2+/-小鼠的氣道炎癥及粘液分泌明顯增加，同時(shí)IL-17A的表達(dá)水平增加。相反，IL-17A-/-小鼠能緩解氣道炎癥、粘

18、液分泌及HDAC2下降水平。HDAC2+/-小鼠中敲除IL-17A基因（即HDAC2+/-/IL-17A-/-小鼠）能緩解HDA2基因敲除導(dǎo)致的氣道炎癥及粘液分泌增加。HDAC2表達(dá)下降通過(guò)調(diào)控CD4+T及γδT細(xì)胞分化促進(jìn)IL-17A分泌，進(jìn)一步惡化哮喘氣道炎癥反應(yīng)。在體外，用HDM體外干預(yù)HBE細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HDM能降低HDAC2的表達(dá)，這一過(guò)程受到IL-17A的調(diào)控。利用SiRNA敲除HBE細(xì)胞的HDAC2基因后，炎癥因子如IL-6、