核盤菌對菌核凈的抗性機理研究.pdf

1、油菜菌核病是由核盤菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary]引起的一種真菌性病害。該病害寄主范圍十分廣泛，發(fā)生在油菜的整個生育期，嚴重影響油菜產(chǎn)量與品質(zhì)。二甲酰亞胺類殺菌劑菌核凈在我國用于防治油菜菌核病已有十幾年，目前部分地區(qū)已監(jiān)測到菌核凈的抗性菌株。本研究以室內(nèi)誘導(dǎo)的菌核凈抗性菌株和田間抗性菌株為試驗材料，測定了室內(nèi)誘導(dǎo)和田間抗性菌株菌核凈抗性水平的遺傳穩(wěn)定性，研究了室內(nèi)誘導(dǎo)抗性菌株冷藏4年后的生

2、物學(xué)特性;比較分析了田間菌核凈抗性與敏感菌株生理生化差異;通過PCR技術(shù)擴增組氨酸激酶HK基因Sshk、反應(yīng)調(diào)控蛋白基因Sssk1、組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移酶基因Ss Ypd和促分裂原活化蛋白激酶基因MAPK(Sssk2、SsPbs和SsHog)，并對其序列進行比對，應(yīng)用RNAi技術(shù)研究核盤菌對菌核凈的抗性機理。主要研究結(jié)果如下:
　　1.在PDA上連續(xù)培養(yǎng)20代后，田間菌核凈抗性菌株(HLJ3、HLJ4和HLJ6)的抗性可以穩(wěn)定遺傳，經(jīng)4

3、℃冷藏4年后，菌核凈抗性依然穩(wěn)定;而室內(nèi)誘導(dǎo)抗性菌株（SCG7和LA50）的抗性在無藥PDA上逐漸衰退，冷藏4年后，對菌核凈的抗性分別下降了99.5％和98.9％。抗性下降后其產(chǎn)核能力、生長速率和致病性顯著增強，滲透壓敏感性顯著降低。并且菌核凈抗性水平與菌絲生長速率(r=-0.980，P=0.021)、致病性(r=-0.997，P=0.002)之間均存在顯著負相關(guān)。
　　2.比較分析了田間菌核凈抗性菌株（HLJ3、HLJ4和HLJ

4、6）與敏感菌株（HLJMG2、HLJMG3和HLJMG5）的生理生化差異。與敏感菌株相比，田間抗性菌株具有較高的細胞膜通透性、POD和PPO酶活性;0.25μg/mL菌核凈處理可顯著提高敏感與抗性菌株的細胞膜通透性和PPO、POD酶活性;草酸和甘油含量在抗性與敏感菌株之間無顯著性差異，但0.25μg/mL菌核凈處理可顯著提高抗性菌株的甘油含量，降低敏感菌株的甘油含量。表明細胞膜通透性及POD、PPO酶活性可能與菌核凈抗性有關(guān)。
　

5、　3.通過PCR擴增組氨酸激酶HK基因Sshk、反應(yīng)調(diào)控蛋白基因Sssk1、組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移酶基因SsYpd和MAPK基因Sssk2、SsPbs和SsHog，發(fā)現(xiàn)抗性菌株HLJ4和HLJ6在基因Sshk中存在單點突變，分別位于第1重復(fù)區(qū)域(I232T)和介于激酶核心區(qū)域與反應(yīng)調(diào)控區(qū)域之間(G1087D);菌株HLJ4在組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移酶基因SsPbs的氨基酸存在點突變(P96L);菌核凈抗性菌株HLJ3和HLJ6均在基因SsYpd(T324

6、C)和Sssk1(A759G)中及HLJ4(C48T)和HLJ3(T1736G)分別在基因Sssk2中發(fā)現(xiàn)同義突變（堿基發(fā)生改變而氨基酸未發(fā)生變化）;菌株HLJ4和HLJ6的Sshk基因表達量顯著高于敏感菌株HLJMG2和抗性菌株HLJ3，且菌核凈處理可顯著上調(diào)3株抗性菌株的Sshk表達水平。表明HK基因Sshk的轉(zhuǎn)錄水平提高可能與菌核凈抗性相關(guān)。
　　4.通過構(gòu)建Sshk基因沉默載體和過量表達載體，應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)(ATM

7、T)篩選獲得轉(zhuǎn)化子，Sshk表達量分析發(fā)現(xiàn):與初始菌株HLJ4相比，3株沉默轉(zhuǎn)化子的Sshk基因表達量分別下調(diào)了99.9％、94.1％和95.1％，對菌核凈的抗性顯著下降，EC50值分別下降了62.9％、42.5％和49.8％;與初始菌株HLJMG1相比，3株過量表達轉(zhuǎn)化子的Sshk基因表達量分別上調(diào)了7.7、10.2和14.1倍，對菌核凈的抗性顯著增強，分別增加了約168.1、189.5和221.2倍。Sshk基因表達量的下調(diào)使HLJ