惡性瘧原蟲(chóng)abstrakt同源基因的克隆及食蟹猴瘧原蟲(chóng)eIF-4A同源蛋白的cDNA克隆、表達(dá)和ATP酶活性研究.pdf

1、DEAD-box蛋白家族的ATP依賴的RNA解旋酶類參與細(xì)胞內(nèi)幾乎所有的RNA代謝過(guò)程，在幾乎所有生物的細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演著眾多不可或缺的角色。瘧疾目前仍然是世界上許多地方的一個(gè)主要的健康問(wèn)題；控制瘧疾的一個(gè)可行的辦法就是研制出通過(guò)阻斷瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)有關(guān)的關(guān)鍵酶來(lái)抑制其生長(zhǎng)的藥物，比如通過(guò)阻斷DNA/RNA解旋酶等。按照此思路，我們進(jìn)行了有關(guān)瘧原蟲(chóng)DNA/RNA解旋酶的研究。本研究主要開(kāi)展了兩個(gè)方面的工作：1.克隆了Plasmodium

2、flaciparumabstrakt全長(zhǎng)基因，分析了該蛋白的結(jié)構(gòu)；并且依據(jù)不同DEAD-box蛋白的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了初步歸類。2.克隆了Plasmodium.cynomolgieIF-4A完整cDNA，表達(dá)了該重組蛋白并對(duì)其ATPase活性進(jìn)行了檢測(cè)。 在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)PCR和探針雜交相結(jié)合的篩選方法，篩選惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumfalciparum)的基因組文庫(kù)，克隆了FH1F—abstrakt同源基因的完整序列。通過(guò)搜

3、索已經(jīng)完成測(cè)序的惡性瘧原蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，推測(cè)FH1F序列定位在第5條連鎖群上。FH1F全長(zhǎng)2804bp，包含一個(gè)1161bp的完整閱讀框，編碼一個(gè)由386個(gè)氨基酸組成的蛋白。對(duì)FH1F蛋白序列用BiastP進(jìn)行搜索和分析以及用DNAStar與許多典型的DEAD-box蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果均提示FH1F蛋白應(yīng)該是DEAD-box家族的一個(gè)Abstrakt蛋白。另一方面，用DNAStar對(duì)已知所有完整的DEAD-box蛋白進(jìn)行詳細(xì)的序

4、列分析以及用Mega對(duì)這些序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究的結(jié)果都顯示：DEAD-box家族的蛋白聚類成為若干不同的亞家族；與DEAD-box蛋白的一般保守序列相比，Abstrakt，eIF-4A，Vasa，P68等不同亞群的DEAD-box蛋白在保守區(qū)具有各自不同的結(jié)構(gòu)特征。本文對(duì)不同的DEAD-box蛋白的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了總結(jié)并試圖給出不同亞群分類上的結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)Abstrakt蛋白在本應(yīng)高度保守的位點(diǎn)上異常于其它DEAD-box蛋白的氨基酸殘基

5、的取代也進(jìn)行了相關(guān)的初步分析。 采用同樣的基因克隆方法篩選食蟹猴瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumcynomolgi)的cDNA文庫(kù)，克隆了一個(gè)eIF-4A同源蛋白的完整cDNA序列，命名為CHlF。CH1F全長(zhǎng)1753bp,包含一個(gè)1197bp的完整閱讀框，推測(cè)編碼一個(gè)由398個(gè)氨基酸組成的蛋白。對(duì)CH1F的蛋白序列用BlastP進(jìn)行搜索和分析，提示它應(yīng)該是DEAD-box家族的一個(gè)eIF-4A同源蛋白；用DNAStar將其與許多典

6、型的DEAD-box蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示：比起其它的DEAD-box蛋白，它與eIF-4A或eIF-4A的同源蛋白具有更高的一致性和更多序列上的相似結(jié)構(gòu)域。將包含完整閱讀框的片段亞克隆到表達(dá)載體pET-28a(+)，在大腸桿菌DH5a中表達(dá)，產(chǎn)生的融合蛋白大小在45kD左右。對(duì)該融合蛋白進(jìn)行純化、重新折疊和初步鑒定。ATP酶活性檢測(cè)顯示，該融合蛋白只有很低的ATP酶活性，而且它的ATP酶活性似乎不依賴于核酸底物。對(duì)這一檢測(cè)結(jié)果