運(yùn)動(dòng)對(duì)肝癌切除術(shù)后小鼠淋巴細(xì)胞增殖及免疫相關(guān)通路的影響.pdf

1、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC，簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌)在2015年中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率中位列第四位，死亡率中位列第三位，是較為兇險(xiǎn)的一種癌癥類(lèi)型。最佳的治療方法依然是早期手術(shù)切除。隨著診療技術(shù)的進(jìn)步，患者在早期得以診斷，肝癌患者手術(shù)切除率及術(shù)后生存率顯著提高，患者對(duì)術(shù)后生活質(zhì)量的提高有著迫切的需求，腫瘤康復(fù)成為研究熱點(diǎn)。但據(jù)相關(guān)機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)，手術(shù)切除后5年的復(fù)發(fā)率依然高于60％，小肝癌經(jīng)過(guò)完整切除后也有40％以上的復(fù)發(fā)

2、率[1]。研究顯示肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)與患者免疫功能有著高度相關(guān)性，在圍手術(shù)期，手術(shù)創(chuàng)傷引起的應(yīng)激反應(yīng)可抑制患者免疫功能，使機(jī)體的免疫功能無(wú)法有效抑制殘余癌細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散，導(dǎo)致術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)增加，與其他部位癌癥相較，患者五年生存率低，生活質(zhì)量差[2]。因此，如何避免肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移成為治療肝癌的重點(diǎn)，改善肝癌患者術(shù)后免疫功能對(duì)于提高肝癌患者的長(zhǎng)期存活率具有重要意義，成為腫瘤康復(fù)的重要議題之一。
　　中醫(yī)藥作為補(bǔ)充替代腫瘤學(xué)的主要手段

3、之一，大大豐富了腫瘤康復(fù)的內(nèi)容。早在春秋戰(zhàn)國(guó)時(shí)期就出現(xiàn)導(dǎo)引術(shù)，作為呼吸運(yùn)動(dòng)和軀體運(yùn)動(dòng)相結(jié)合的醫(yī)療體育方法。導(dǎo)引術(shù)最早見(jiàn)于《莊子·刻意》，在《金匱要略》中就已出現(xiàn)用導(dǎo)引術(shù)治療相關(guān)疾病的條目。在馬王堆漢墓中出土的《導(dǎo)引圖》中詳細(xì)記載了44幅小型全身導(dǎo)引圖。至隋朝，導(dǎo)引術(shù)正式作為醫(yī)療手段記載于巢元方的《諸病源候論》中，并提出肝臟疾病的導(dǎo)引治療方法。
　　現(xiàn)代醫(yī)學(xué)建議運(yùn)動(dòng)療法作為腫瘤術(shù)后康復(fù)的主要治療手段之一，適度且有規(guī)律的長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體

4、的免疫功能有很好的提高作用，具體主要體現(xiàn)在提高免疫細(xì)胞及相關(guān)免疫因子的活性。且有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，中等強(qiáng)度的長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉對(duì)緩解和抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)擴(kuò)散有幫助[3]。
　　但是腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制是十分復(fù)雜的，目前關(guān)于運(yùn)動(dòng)對(duì)肝癌術(shù)后患者的影響尚缺乏相關(guān)資料，尚無(wú)一套明確且規(guī)范的運(yùn)動(dòng)方案用于肝癌患者術(shù)后康復(fù)，也缺乏該階段運(yùn)動(dòng)與免疫狀態(tài)相關(guān)的客觀理論依據(jù)。
　　本研究構(gòu)建了肝原位移植瘤切除術(shù)后小鼠模型，并對(duì)模型小鼠術(shù)后自發(fā)活動(dòng)度、肝功能

5、、淋巴細(xì)胞細(xì)胞功能等進(jìn)行研究，探索模型小鼠在術(shù)后一般狀態(tài)及免疫功能的恢復(fù)情況。在分析模型小鼠術(shù)后狀態(tài)后，在術(shù)后不同時(shí)間對(duì)小鼠進(jìn)行不同強(qiáng)度的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，觀察運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響并進(jìn)一步研究運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力影響的分子機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　一 肝原位移植瘤切除術(shù)對(duì)小鼠一般狀態(tài)及免疫功能的影響
　　目的:
　　構(gòu)建肝原位移植瘤切除術(shù)后小鼠模型，觀察手術(shù)對(duì)小鼠一般狀態(tài)和免疫功能的影響。
　　方

6、法:
　　1、構(gòu)建肝原位移植瘤切除術(shù)后小鼠模型，采用自發(fā)活動(dòng)儀觀察模型小鼠術(shù)后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)（術(shù)后第一天、第三天、第五天、第七天、第九天）自發(fā)活動(dòng)度水平。
　　2、采集模型小鼠外周血，檢測(cè)其血清白蛋白(albumin，ALB)、膽紅素(totalbilirubin，TB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartatetransaminase，AST)、乳酸脫氫酶(lac

7、tate dehydrogenase，LDH)分泌水平。
　　3、制備模型小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(erzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)法檢測(cè)其IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子分泌水平。
　　4、MTT比色法檢測(cè)各組模型小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力。
　　5、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)模型小鼠脾淋巴細(xì)胞表面CD4+/CD8+比例。

8、　　結(jié)果:
　　1、本研究結(jié)果表明，模型小鼠術(shù)后第一、三、五天的自發(fā)活動(dòng)總路程分別為(782.54±142.95)cm、(932.22±46.90)cm、(1040.57±208.83)cm，與正常組小鼠(1291.06±79.96)cm相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。第七天模型小鼠自發(fā)活動(dòng)總路程(1212.07±85.50)cm和第九天模型小鼠自發(fā)活動(dòng)總路程(1144.11±59.79)cm與正常小鼠比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

9、意義。
　　2、通過(guò)檢測(cè)小鼠血清發(fā)現(xiàn)，模型小鼠術(shù)后第一天肝功能損傷最為嚴(yán)重，除ALB外，TB為(2.4±0.16)umol/L、ALT為(364.00±46.5)u/L、AST為(1453.60±295.29)u/L、LDH為(2853.60±249.73)u/L均遠(yuǎn)高于正常小鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，ALT、AST、LDH趨勢(shì)一致，均在術(shù)后快速升高，第一天即達(dá)到峰值，之后逐步下降。TB的升高遲于轉(zhuǎn)氨酶的變化，結(jié)果顯示，TB在

10、術(shù)后第一天上升(2.4±0.16)umol/L，第三天達(dá)到峰值(2.42±0.23) umol/L，后逐步下降。ALB各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、術(shù)后第一天和第三天小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率分別為(85.27±0.04)％和(97.54±0.16)％，均小于正常小鼠(172.38±0.21)％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但小鼠的免疫功能在逐步恢復(fù)，術(shù)后第七天淋巴細(xì)胞增殖能力為(128.51±0.27)％，較第一天小鼠的免疫

11、功能有所提高。
　　4、術(shù)后小鼠各個(gè)炎癥細(xì)胞因子分泌水平遠(yuǎn)高于正常小鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。除TGF-β外，各個(gè)細(xì)胞因子均在術(shù)后快速升高，第一天即達(dá)到峰值，之后逐步下降。說(shuō)明手術(shù)破壞了Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞因子平衡，導(dǎo)致Th極化漂移，產(chǎn)生免疫紊亂。
　　5、在本實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后第一天組小鼠淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+比值為(1.61±0.33)，術(shù)后第三天組小鼠淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+比值為(3.21±0.45)，

12、術(shù)后第五天組小鼠淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+比值為(3.40±0.34)，三組與正常小鼠相較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05），正常組小鼠淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+比值為(5.46±1.07)。且術(shù)后第七天組小鼠也高于術(shù)后前五天組小鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　較正常小鼠，肝原位移植瘤手術(shù)對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)水平和肝功能造成損傷，抑制機(jī)體淋巴細(xì)胞增殖，使CD4+/CD8+比值失調(diào)，說(shuō)明肝原位瘤切除術(shù)對(duì)小

13、鼠造成了應(yīng)激損傷，產(chǎn)生了免疫抑制。
　　二 運(yùn)動(dòng)對(duì)肝原位移植瘤切除術(shù)后小鼠淋巴細(xì)胞增殖及部分免疫相關(guān)通路的影響
　　目的:
　　觀察不同運(yùn)動(dòng)時(shí)機(jī)和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)原位移植瘤切除術(shù)后小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響及其機(jī)制。
　　方法:
　　1、制備肝原位瘤術(shù)后小鼠模型，對(duì)小鼠在不同運(yùn)動(dòng)介入時(shí)間進(jìn)行不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的干預(yù)。
　　2、制備模型小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，采用MTT比色法檢測(cè)運(yùn)動(dòng)對(duì)模型小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響。<

14、br>　　3、采用PathScan(R)抗體芯片技術(shù)進(jìn)行初篩，蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot，WB)進(jìn)行驗(yàn)證，探尋運(yùn)動(dòng)對(duì)肝原位移植瘤切除術(shù)后小鼠免疫功能影響的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1、在術(shù)后早期進(jìn)行中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力影響不大，為(258.24±0.64)％，與正常小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力(297.91±0.28)％之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)干預(yù)在一定程度上抑制了模型小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力，

15、為(142.03±0.24)％，低于正常小鼠，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2、在術(shù)后后期進(jìn)行中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)干預(yù)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力為(221.76±0.24)％，與正常小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力(194.16±0.71)％之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)在一定程度上增強(qiáng)了模型小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力，為(359.87±0.78)％，高于正常小鼠，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　3、經(jīng)過(guò)PathScan(

16、R)抗體芯片技術(shù)初篩后發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)對(duì)肝原位移植瘤切除術(shù)后小鼠淋巴細(xì)胞的影響主要是通過(guò)IL6/JAK2/STAT3和PI3k/AKT/mTOR/STAT3兩條通路。經(jīng)過(guò)WB驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)術(shù)后后期運(yùn)動(dòng)可以提高磷酸化STAT3、磷酸化AKT等關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，對(duì)淋巴細(xì)胞增殖起正向調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)論:
　　術(shù)后早期進(jìn)行高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力存在負(fù)向調(diào)節(jié)作用，術(shù)后后期進(jìn)行高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力有促進(jìn)作用。運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)IL