丙酮酸乙酯對THP-1源性泡沫細胞自噬和凋亡的影響.pdf

1、目的:
　　巨噬細胞吞噬氧化低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoproteins，ox-LDL)并轉化為泡沫細胞。研究發(fā)現(xiàn)，泡沫細胞大量死亡可導致局部堆積大量脂質，斑塊進展甚至破裂。細胞死亡方式包括:自噬性死亡，凋亡和壞死。丙酮酸乙酯(Ethyl pyruvate，EP)是一種丙酮酸衍生物，多個研究顯示該藥物能通過抑制細胞自噬和凋亡，減少細胞死亡，從而發(fā)揮對臟器的保護作用。本研究擬觀察EP對泡沫細胞

2、自噬和凋亡的影響，并初步探討可能的機制。
　　方法:
　　1.THP-1源性泡沫細胞模型的構建:用不同濃度ox-LDL(0mg/L～150mg/L)誘導構建THP-1源性泡沫細胞模型。之后用油紅O染色鑒定造模情況，用MTT法測細胞生存率。
　　2.ox-LDL刺激對泡沫細胞自噬和凋亡的影響:THP-1細胞經PMA誘導貼壁后，給予不同濃度的ox-LDL(0mg/L～150mg/L)孵育24小時，用流式細胞術檢測細胞自噬和

3、凋亡水平，以篩選最佳模型構建條件。
　　3.EP對THP-1源性泡沫細胞自噬及凋亡的影響:用上述研究篩選的最適ox-LDL濃度刺激泡沫細胞生成，應用不同濃度EP(5mM～20mM)進行干預，觀察其對泡沫細胞自噬和細胞凋亡的影響。分組如下:①對照組:不加任何干預因素;②泡沫細胞組:加入100mg/L的ox-LDL;③低濃度EP組:加入100mg/L的ox-LDL和5mM的EP;④中濃度EP組:加入100mg/L的ox-LDL和10m

4、M的EP;⑤高濃度EP組:加入100mg/L的ox-LDL和20mM的EP。共同孵育24小時后，用western blot、流式細胞術、免疫熒光、PCR技術觀察細胞自噬水平、細胞凋亡率。評估不同濃度EP對THP-1源性泡沫細胞脂質蓄積、細胞自噬和細胞凋亡的影響。用免疫熒光、PCR技術評估各組HMGB1水平表達的差異。
　　4.EP對泡沫細胞自噬和凋亡影響可能的分子機制:用免疫熒光、PCR技術評估ox-LDL組與ox-LDL+20m

5、MEP組HMGB1、Beclin1、Rage等基因水平表達的差異，探討EP作用于泡沫細胞自噬和凋亡水平可能的機制。
　　結果:
　　1.ox-LDL為25mg/L時，細胞生存率即下降至87.18％±5.34％（與對照組比較P＜0.05）。隨著ox-LDL濃度升高，細胞活力逐漸下降，油紅O染色可見泡沫細胞內大量脂滴。
　　2.THP-1源性泡沫細胞自噬率及凋亡率水平隨著ox-LDL濃度增高增加，0mgL組，25mg/L組

6、，50mg/L組，100mg/L組，150mg/L組的自噬率分別為0.05％±0.01％,1.28％±0.32％,2.09％±0.17％,5.01％±0.33％,5.41％±0.27％，凋亡率分別為10.01％±0.19％，20.36％±3.42％，29.83％±6.27％，49.29％±10.66％，62.70％±1.95％。但100mg/L組與150mg/L組間差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　3.流式細胞術、real

7、-time PCR、Western blot等檢測手段證實，隨著EP濃度增高，自噬率、自噬相關基因的表達水平逐漸下降。泡沫細胞組凋亡率較對照組明顯增加(48.77％±7.22 VS5.87±1.03)(P＜0.05)。不同濃度EP組(5mM，10mM，20mM)細胞凋亡率分別為26.12％±3.99％，12.92％±1.32％，9.46％±0.53％，均較泡沫細胞組明顯下降(P＜0.05)，凋亡標志性蛋白caspase-3表達隨著EP濃

8、度增加而減少。即隨著EP濃度升高，凋亡率下降明顯。
　　4.免疫熒光染色、PCR顯示ox-LDL+20mMEP組HMGB1、Beclin1、Rage和TNF-α基因mRNA表達水平較ox-LDL組顯著下降。
　　結論:
　　1.以PMA誘導THP-1細胞24小時可以促使該細胞貼壁分化為巨噬細胞;之后再以ox-LDL誘導泡沫細胞形成。方法簡單可重復性好。
　　2.在ox-LDL誘導THP-1源性泡沫細胞中自噬和凋亡