海洋鏈霉菌輔酶依賴型氧化還原酶(CHIE4)的體外重組表達(dá)及功能初步研究.pdf

1、高鹽、高壓、低溫、低氧和寡營養(yǎng)等極端環(huán)境造就了海洋鏈霉菌獨(dú)特的代謝方式，使其次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富多樣進(jìn)而成為新型活性物質(zhì)的重要來源。分離自青島膠州灣的海洋鏈霉菌（Streptomyces griseoaurantiacus）菌株M045能夠產(chǎn)生手霉素A、中尼霉素A和B等多種抗生素。其中，中尼霉素A是由前體物質(zhì)手霉素A經(jīng)輔酶依賴型氧化還原酶CHIE4催化合成。研究表明中尼霉素可抑制黑色素瘤與乳腺癌的發(fā)生，并對(duì)農(nóng)作物病原真菌具有抑制活性，因而具

2、有較高的研究與應(yīng)用價(jià)值。
　　本課題采用多種蛋白表達(dá)系統(tǒng)對(duì)來自海洋鏈霉菌菌株M045的CHIE4進(jìn)行了體外重組表達(dá)研究。結(jié)果表明，由原核表達(dá)載體pET28表達(dá)的CHIE4會(huì)形成包涵體，通過透析和復(fù)性等處理能夠獲得可溶性的CHIE4，但是活性檢測發(fā)現(xiàn)該CHIE4的催化活性基本喪失。利用原核表達(dá)載體pMAL-p5x和pMAL-c5x可獲得與麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽融合表達(dá)的可溶性CHIE4。該融合蛋白經(jīng)MBP親和層析、TEV蛋白酶酶切和Ni

3、柱串聯(lián)親和層析可得到純化的單一CHIE4，活性檢測實(shí)驗(yàn)證實(shí)該CHIE4具備催化活性。實(shí)驗(yàn)同時(shí)證實(shí)利用真核表達(dá)載體pPIC9K和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)無法獲得CHIE4的表達(dá)。
　　輔酶依賴型氧化還原酶CHIE4的編碼基因GC含量高達(dá)65%，原核表達(dá)易形成包涵體，變性復(fù)性后蛋白又極易失去催化活性，為CHIE4的生產(chǎn)應(yīng)用帶來挑戰(zhàn)。本研究利用麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽融合表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)蛋白酶切和串聯(lián)親和層析獲得了具有催化活性的CHIE4，為實(shí)現(xiàn)CHIE