N-糖酰胺酶F的性質(zhì)及脫糖基化作用的研究.pdf

1、N-糖酰胺酶F(Peptide-N4-(N-acetyl-β-D-glucosaminyl)asparigineamidase；PNGaseF；EC3.5.1.52)能夠在溫和的條件下從糖肽、糖蛋白上面完整切下N-連接的寡糖鏈(N-糖苷)，將寡糖鏈和蛋白部分分開。糖酰胺酶F具有廣泛的底物專一性，對所有類型的N-寡糖鏈都有作用。這些特性使糖酰胺酶F在糖鏈結構分析、糖鏈在生物體內(nèi)的作用和糖鏈對糖蛋白的作用的研究中起到了重要的作用。現(xiàn)在商業(yè)化

2、的N-糖酰胺酶F主要從腦膜炎膿桿菌(Flavobacteriummeningosepticum)中提取。提取和純化N-糖酰胺酶F是一個十分耗費和耗時的工作，因此市場價格十分昂貴，這大大限制了N-糖酰胺酶的廣泛利用和N-糖鏈大規(guī)模制備。 為了獲得大量廉價的N-糖酰胺酶F，本論文研究的主要內(nèi)容為根據(jù)目的基因N-糖酰胺酶F的cDNA序列設計引物，以Fmeningosepticum菌株的基因組為模板，進行PCR擴增反應；將所得的DNA片

3、段經(jīng)雙酶切后與載體pYD1質(zhì)粒進行連接，然后導入大腸桿菌DH5α，用Ampr篩選陽性克隆并用雙酶切和PCR鑒定重組質(zhì)粒pYD1/PNGaseF。轉化釀酒酵母EBY100(Saccharomycescerevisiae)，N-糖酰胺酶F將通過酵母菌的分泌系統(tǒng)和Aga1-Aga2融合蛋白自動連接到酵母菌細胞壁上，實現(xiàn)N-糖酰胺酶F的表達—純化—固定一步化。通過免疫熒光試驗證明N-糖酰胺酶F已經(jīng)成功的錨定在EBY100酵母細胞表面。經(jīng)流式細胞

4、儀(FACS)檢測，N-糖酰胺酶F細胞表面錨定率最大達到47％。通過摸索培養(yǎng)和誘導條件的優(yōu)化試驗，發(fā)現(xiàn)首先在包含2％葡萄糖的YNB-CAA(0.67％YNB；0.5％Casaminoacids)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當菌體濃度達到OD600=2.2時，轉接到含有2％半乳糖的YNB-CAA培養(yǎng)基中，使OD600=0.8；20℃誘導培養(yǎng)36h離心收集菌體，每升發(fā)酵液可獲得13g錨定有N-糖酰胺酶F的菌體。以糖蛋白RNaseB、IgG、人轉鐵蛋白為酶

5、反應底物對表面錨定有N-糖酰胺酶F酵母細胞進行酶活專一性試驗，證明該固定化酶對三種類型的糖蛋白都有作用。以糖蛋白RNaseB為酶反應底物對該固定化酶的最優(yōu)溫度、pH、誘導條件進行測定，確定最優(yōu)酶反應條件為pH5.5，溫度為37℃，最佳誘導條件36h。 為了得到可溶性的N-糖酰胺酶F，將N-糖酰胺酶F基因重組到pET28a載體上，在大腸桿菌中進行誘導表達，表達量在30％以上。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，在34kD有一條目的帶。經(jīng)N