羅仙子初提物的抗衰老藥效及其抗氧化機(jī)制初探.pdf

1、衰老是一種自然的，持續(xù)發(fā)生的變化過程。自由基學(xué)說（Free radicle theory，F(xiàn)R）是最具代表性的衰老學(xué)說之一，該學(xué)說認(rèn)為自由基損傷人體細(xì)胞，從而引起眾多疾病，加速人體衰老?？寡趸穷A(yù)防衰老的重要步驟，抗氧化劑是任何以低濃度存在就能有效抑制自由基氧化反應(yīng)的物質(zhì)，開發(fā)實(shí)用、高效、低毒的天然抗氧化劑是今后研究的重點(diǎn)。中藥羅仙子原名家蠅蛆，俗稱蛆，其成蟲家蠅常出沒于污穢之地，置身于不計其數(shù)的病菌（包括寄生蟲、病毒、細(xì)菌、甚至是抗生

2、素耐藥的細(xì)菌等）之中，卻能安然無恙，不被這些病原體感染，這源于其優(yōu)異的免疫功能。近年來，國內(nèi)外的研究人員對羅仙子的研究，大多集中在活性肽上，他們發(fā)現(xiàn)羅仙子提取物中富含凝集素、溶菌酶、抗菌蛋白等活性成分，具有抗細(xì)菌、真菌、病毒等病原體和抗腫瘤細(xì)胞的作用。本實(shí)驗室前期在研究羅仙子提取物對高脂血癥大鼠血脂調(diào)節(jié)及肝臟保護(hù)的作用時發(fā)現(xiàn)，羅仙子提取物使肝臟勻漿中超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）的活性明顯升高，丙二醛

3、（Malondialdehyde，MDA）水平明顯下降，提示羅仙子提取物可能具有通過清除自由基來增強(qiáng)抗氧化能力的作用。隨著研究的深入，一些研究還發(fā)現(xiàn)了羅仙子提取物可以清除自由基和抵抗重金屬脅迫，但是大多都只是研究了家蠅幼蟲初提物的清除自由基方面。本研究通過D-半乳糖（D-galactose，D-gal）致衰老小鼠模型和自然衰老大鼠模型對羅仙子初提物的抗衰老藥效進(jìn)行評價并初步探討其抗氧化機(jī)制，在此基礎(chǔ)上，初步摸索了羅仙子初提物的酶解工藝，

4、為從傳統(tǒng)中藥羅仙子中開發(fā)出一種抗衰老候選藥物分子提供理論基礎(chǔ)，也為羅仙子抗氧化肽的提取分離打下基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗方法：
　　1.利用D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠模型評價羅仙子初提物的抗衰老藥效及其抗氧化機(jī)制昆明小鼠48只，隨機(jī)分為正常對照組、衰老模型組、維生素E（Vitamin E，Vit E）對照組和羅仙子初提物低、中、高劑量組，每組8只。除正常對照組外，其余各組均按10 mg/kg給予D-gal頸背部皮下注射，每日一次，連續(xù)注射6周

5、，同時Vit E組和羅仙子初提物低、中、高劑量組按10 ml/kg灌胃給藥。造模給藥0 d始，每天測定小鼠的體重，并觀察各組小鼠形態(tài)行為學(xué)的改變；造模給藥第30 d時，進(jìn)行小鼠避暗實(shí)驗；造模給藥6周后處死小鼠，檢測小鼠血清、肝臟和腦組織中各項抗氧化相關(guān)指標(biāo)。
　　2.利用自然衰老大鼠模型評價羅仙子初提物的抗衰老藥效及其抗氧化機(jī)制
　　10-11月齡的大鼠在SPF環(huán)境飼養(yǎng)9個月，飼養(yǎng)至19-20月齡，隨機(jī)分為5組，分別為：衰老

6、模型組、Vit E對照組和羅仙子初提物低、中、高劑量組，每組8只。青年對照組在衰老模型組的大鼠造模且臨近給藥的前10天購進(jìn)，適應(yīng)性飼養(yǎng)10天。羅仙子初提物各劑量組和Vit E組按10 ml/kg，灌胃給藥，每日一次，連續(xù)2個月。青年對照組和衰老模型組給予同體積的生理鹽水。造模給藥0d始，每月測定大鼠的體重，并觀察各組大鼠形態(tài)學(xué)的改變；給藥結(jié)束進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗后，大鼠注射乙醚麻醉，腹主動脈取血；取血后迅速取出腦組織。
　　

7、3.初步酶解羅仙子初提物
　　利用Alcalase堿性蛋白酶對羅仙子初提物進(jìn)行酶解，高效液相色譜分析（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）酶解前后組分差異，并測定其清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinit-rophenyl)hydrazyl)，DPPH·）

8、自由基的活性；在此基礎(chǔ)上，采用單因素分析酶解條件（具體為pH、溫度、底物濃度、加酶量和酶解時間等）對酶解的影響。
　　實(shí)驗結(jié)果：
　　1.利用D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠模型評價羅仙子初提物的抗衰老藥效及其抗氧化機(jī)制
　　與正常對照組相比，衰老模型組小鼠體重增加速率明顯減慢，學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退，小鼠血清，肝臟，腦組織中的SOD活性和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）活力均降低，MD

9、A含量增加。與衰老模型組相比，Vit E組和羅仙子初提物各劑量組體重增加速率升高，學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)，小鼠血清，肝臟，腦組織中的SOD活性升高，MDA含量減少，GSH-PX活力增強(qiáng)。
　　2.利用自然衰老大鼠模型評價羅仙子初提物的抗衰老藥效及其抗氧化機(jī)制
　　與青年對照組相比，衰老模型組大鼠活動緩慢，皮膚污穢無澤，體重隨周齡的增加不明顯；Morris水迷宮定向航行實(shí)驗中存在潛在的學(xué)習(xí)記憶功能障礙；大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)中神經(jīng)元胞質(zhì)

10、，胞體和突起中出現(xiàn)溶酶體；胞體中線粒體出現(xiàn)腫脹，線粒體中嵴的溶解和消失；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，網(wǎng)腔的擴(kuò)張，游離核糖體密度降低，數(shù)量減少，分布不均，呈不規(guī)則排列，扭曲和膨脹，且有部分游離到了細(xì)胞質(zhì)中；神經(jīng)突觸間隙及突觸前、后膜結(jié)構(gòu)模糊，神經(jīng)突觸連接變少；腦組織中SOD活性和GSH-PX活力降低，MDA含量升高。與衰老模型組相比，Vit E組和羅仙子初提物各劑量組體重隨周齡增加，學(xué)習(xí)記憶功能障礙減輕，大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)中神經(jīng)元胞質(zhì)，胞體和突起中溶

11、酶體數(shù)量減少；胞體中線粒體腫脹減弱，線粒體中嵴的溶解情況也得到了緩解；神經(jīng)突觸間隙及突觸前、后膜結(jié)構(gòu)較清晰；腦組織中的SOD活性升高，MDA含量減少，GSH-PX活力增強(qiáng)。
　　3.初步酶解羅仙子初提物
　　對羅仙子初提物進(jìn)行酶解后，通過HPLC上樣分析和測定其清除DPPH·自由基活性發(fā)現(xiàn)，酶解前后的羅仙子初提物的色譜圖譜存在差異，且酶解后的羅仙子初提物具有更好的清除DPPH·的活性。通過后續(xù)對酶解條件進(jìn)行優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，酶解時

12、的底物濃度，酶解pH和酶解溫度對酶解效率的影響較大，而加酶量和酶解時間對酶解效率的影響較小。
　　結(jié)論：
　　本研究分別利用D-gal致亞急性衰老小鼠模型和自然衰老大鼠模型綜合評價羅仙子初提物的抗衰老藥效，實(shí)驗結(jié)果顯示，D-gal致亞急性衰老小鼠模型及自然衰老組大鼠與正常對照組對比，均出現(xiàn)衰老的癥狀；而羅仙子各劑量組和Vit E組的實(shí)驗動物衰老癥狀均有所減輕；通過觀察各組實(shí)驗動物行為，測定體內(nèi)抗氧化相關(guān)指標(biāo)，檢測超微結(jié)構(gòu)等，

13、分析發(fā)現(xiàn)羅仙子初提物可能通過清除自由基等作用來提高機(jī)體的抗氧化能力，進(jìn)而改善超微結(jié)構(gòu)的一些衰老癥狀，從而達(dá)到延緩衰老的作用。對羅仙子初提物進(jìn)行初步酶解后，通過HPLC上樣分析和測定其清除DPPH·自由基活性發(fā)現(xiàn)，酶解前后的羅仙子初提物的色譜圖片存在差異，說明羅仙子初提物酶解后，確實(shí)水解出了某些具有抗氧化活性的小分子多肽。通過后續(xù)初步對酶解條件的優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，酶解時底物濃度，酶解pH和酶解溫度對酶解效率的影響較大，而加酶量和酶解時間對酶解效率