天然鈣網(wǎng)蛋白和重組鈣網(wǎng)蛋白免疫生物學(xué)活性的比較研究.pdf

1、鈣網(wǎng)蛋白（Calreticulin，CRT）是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，由Thomas J.Ostwald等1974年首次從兔的基質(zhì)網(wǎng)中分離出來。CRT是一個酸性的Ca2+結(jié)合蛋白，分子量約為46kD，分為N、P、C三個結(jié)構(gòu)域。N和P連接部位為該蛋白發(fā)揮分子伴侶功能的重要區(qū)域，C端是一個酸性結(jié)構(gòu)區(qū)域，結(jié)合有大量的Ca2+，被譽(yù)為細(xì)胞內(nèi)的“鈣庫”。近年來的研究表明，CRT還存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外并發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，諸如參與適應(yīng)性免疫的抗原加工和遞呈

2、、抗腫瘤免疫應(yīng)答、介導(dǎo)凋亡細(xì)胞的吞噬、細(xì)胞的粘附和遷移以及免疫細(xì)胞的增殖和活化等。
　　 為了進(jìn)一步研究CRT的免疫生物學(xué)活性，我們以新鮮鼠肝作為原材料，利用硫酸銨沉淀和DEAE陰離子交換層析等方法從收集的鼠肝細(xì)胞中純化得到天然鈣網(wǎng)蛋白（Native calreticulin，N-CRT）。同時，我們還利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)了重組鈣網(wǎng)蛋白(Recombinant calreticulin，rCRT)，并用Ni+柱對其進(jìn)行純化，得到

3、了較高純度的蛋白。因?yàn)閞CRT存在較大量多聚體的情況，我們利用凝膠過濾的方法對其進(jìn)行了分離，得到了rCRT多聚體(PrCRT)，rCRT單體Ⅰ(MrCRTⅠ)，rCRT單體Ⅱ(MrCRTⅡ)等三個組分。在此基礎(chǔ)上，我們對上述幾種成分刺激腹腔巨噬細(xì)胞(PMC)的活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)rCRT和PrCRT具有很強(qiáng)的刺激細(xì)胞產(chǎn)生NO、TNF-α和IL-6的活性，而N-CRT、MrCRTⅠ和MrCRTⅡ的活性則相對較弱。鑒于多聚體強(qiáng)烈的功能可能受

4、到原核表達(dá)系統(tǒng)中內(nèi)毒素的污染，我們利用N-CRT研究了其與LPS可能存在的協(xié)同刺激活性。結(jié)果表明，N-CRT不能和LPS結(jié)合，也不具有協(xié)同增強(qiáng)LPS活性的功能。
　　 我們還利用N-CRT，rCRT，PrCRT，MrCRTⅠ，MrCRTⅡ分別免疫了C57BL/6小鼠，分析其刺激小鼠產(chǎn)生抗體的情況。結(jié)果表明，N-CRT，MrCRTⅠ，MrCRTⅡ均不能免疫小鼠產(chǎn)生特異性的抗體，而rCRT和PrCRT均能產(chǎn)生高滴度的特異性抗體。