結(jié)腸粘膜NR2B通過proBDNF和mBDNF參與IBS-D內(nèi)臟高敏感的發(fā)生.pdf

1、背景:
　　NMDA受體為一種離子型谷氨酸鹽受體，由2個(gè)NR1(NMDA receptor1)亞基和2個(gè)NR2(NMDA receptor2)亞基組成。其中NR2亞基包含四個(gè)亞型（NR2A、NR2B、NR2C、NR2D）。既往研究表明NMDA受體在IBS患者腸粘膜表達(dá)增高并參與IBS內(nèi)臟高敏感的發(fā)生。然而哪種NMDA受體亞型在該機(jī)制中起關(guān)鍵作用目前尚不清楚。在本研究中，我們將探討NMDA受體亞型在IBS-D患者內(nèi)臟高敏感中的作用。

2、然而NMDA受體并不能直接誘導(dǎo)內(nèi)臟高敏感，需要借助受體活化后的產(chǎn)物。
　　腦源性神經(jīng)生長因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)具有多種功能，在神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞的生存，突觸的可塑性和疼痛的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。既往研究表明，NMDA受體可誘導(dǎo)成熟BDNF(mature BDNF, mBDNF)的合成。因此，作為合成mBDNF的中間產(chǎn)物，前體BDNF(the precursor of bra

3、in derivedneurotrophic factor，proBDNF)也可由NMDA受體誘導(dǎo)產(chǎn)生。近期研究表明proBDNF表達(dá)于腸粘膜并具有促進(jìn)炎癥性、內(nèi)臟性、手術(shù)性疼痛的作用。本研究將探討proBDNF在內(nèi)臟高敏感中的作用，并研究該N2亞型是否通過proBDNF參與內(nèi)臟高敏感的發(fā)生。
　　近期一項(xiàng)研究表明腸粘膜NMDA受體通過誘導(dǎo)mBDNF的產(chǎn)生參與內(nèi)臟高敏感，然該研究并未涉及亞基探討。因此我們將同時(shí)探討該亞型是否也通過

4、mBDNF參與內(nèi)臟高敏感機(jī)制的發(fā)生。
　　目的:
　　1.探討NMDA受體哪種亞型在IBS-D患者腸粘膜表達(dá)增高并參與內(nèi)臟高敏感的發(fā)生;
　　2.探討proBDNF在IBS-D患者腸粘膜表達(dá)情況及是否與IBS內(nèi)臟高敏感相關(guān);
　　3.探討NMDA受體該亞型是否通過proBDNF參與IBS-D內(nèi)臟高敏感的發(fā)生;
　　4.探討該亞型是否通過mBDNF促進(jìn)IBS-D內(nèi)臟高敏感的發(fā)生。
　　方法:
　　

5、1.臨床試驗(yàn)
　　根據(jù)羅馬Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)納入IBS-D患者及健康對照者，每位參與者完成一份信息采集及腸道功能評分量表，進(jìn)行腹部疼痛/不適嚴(yán)重程度及頻率評分。每位參與者進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查，于直乙交界處鉗取3塊腸粘膜標(biāo)本，1塊用于免疫組化檢查，2塊用于western blot檢查。
　　2.細(xì)胞試驗(yàn)
　　以人結(jié)腸上皮細(xì)胞系ht-29為研究對象，分別以MK-801阻斷NMDA受體以Ro25-6981特異性阻斷NR2B亞型。實(shí)時(shí)熒光定量R

6、T-PCR、western blot檢測proBDNF的表達(dá)，western blot、ELISA檢測mBDNF的表達(dá)。
　　為了研究NMDA受體活化后對proBDNF及mBDNF合成的直接作用，激動劑組分為5組，分別為50μ M NMDA與10μMD-絲氨酸組，100μ M NMDA與10μ MD-絲氨酸組，500μ M NMDA與10μMD-絲氨酸組，100μMNMDA組，10μM D-絲氨酸組，于3h、6h、12h、24h、

7、48h獲取細(xì)胞或培養(yǎng)基后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為了評估NR2B亞基對BDNF合成作用的影響，分別用MK-801阻斷全部NMDA受體和Ro25-6981特異性阻斷NR2B亞基，比較兩者對proBDNF及mBDNF合成的影響。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　兩組之間計(jì)量資料的比較均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法，分類變量的比較采取Fisher確切概率法。多組樣本的比較采用單因素ANOVA分析，隨后組間的兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。NR2B與proBD

8、NF/mBDNF的相關(guān)性采取Pearson線性相關(guān)。proBDNF/mBDNF蛋白表達(dá)與腹部疼痛評估的相關(guān)性采取Spearman秩相關(guān)。P值小于0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.臨床試驗(yàn)
　　1) NMDA受體NR2亞基四個(gè)亞型均主要表達(dá)于腸粘膜腸上皮細(xì)胞;
　　2) IBS-D患者腸粘膜中，NMDA受體只有NR2B亞型表達(dá)增高，且與患者腹部疼痛/不適評分及頻率呈正相關(guān);
　　3) IBS-

9、D患者腸粘膜中，proBDNF表達(dá)增高，且與腹部疼痛/不適嚴(yán)重程度評分及頻率呈正相關(guān);
　　4) NR2B亞型表達(dá)與proBDNF的表達(dá)呈正相關(guān);
　　5) IBS-D患者腸粘膜中，mBDNF表達(dá)增高，且與腹部疼痛/不適嚴(yán)重程度評分及頻率呈正相關(guān);
　　6) NR2B亞型表達(dá)與mBDNF表達(dá)也呈正相關(guān)。
　　2.細(xì)胞試驗(yàn)
　　在ht-29細(xì)胞，激動NMDA受體后可引起proBDNF和mBDNF表達(dá)增高，且p