雙shRNA表達(dá)載體對(duì)HSV-2的UL27、UL54基因的干擾作用.pdf

1、目的：構(gòu)建針對(duì)HSV-2的UL27和UL54的雙shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體，探討雙shRNA表達(dá)載體對(duì)雙靶基因的干擾作用以及對(duì)HSV-2病毒增殖的影響。
　　方法：利用pGenesil10-3p質(zhì)粒構(gòu)建的靶向UL27、UL54的雙shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體（Dual-shRNA），靶向UL27的單shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體（UL27-shRNA）和靶向UL54的單shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體（UL54-shRNA），通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，

2、采用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，并對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞接種HSV-2病毒。24 h后采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；終點(diǎn)滴定法檢測(cè)細(xì)胞上清液中病毒滴度；QPCR（Quantitative Real-time PCR，QPCR）檢測(cè)UL27和UL54的mRNA的表達(dá)水平；蛋白印跡法檢測(cè)gB和ICP27蛋白表達(dá)量，比較雙 shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體介導(dǎo)雙基因干擾與UL27-shRNA+UL54-shRNA聯(lián)合介導(dǎo)的雙基因干擾以及單基因干擾對(duì) UL27、UL54

3、的抑制效果，探討雙shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體對(duì)HSV-2病毒增殖的影響。
　　結(jié)果：（1）MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，單基因干擾組UL27-shRNA、UL54-shRNA均能不同程度提高細(xì)胞存活率，分別為78±2.65％，68.67±3.21%；聯(lián)合干擾和Dual-shRNA組的細(xì)胞存活率最高，分別為91.67±1.53%、90.33±1.15%；聯(lián)合干擾、Dual-shRNA、單干擾組同陰性對(duì)照組相比具有顯著差異（P<0.05），聯(lián)合干

4、擾組與 Dual-shRNA組之間無(wú)顯著差異。（2）終點(diǎn)滴定法測(cè)定結(jié)果顯示，各干擾組子代病毒滴度均有不同程度降低，單干擾組 UL27-shRNA、UL54-shRNA的子代病毒滴度分別為10-3.2±0.3、10-3.4±0.1；聯(lián)合干擾組和Dual-shRNA作用較為明顯其子代病毒滴度分別為10-2.07±0.15、10-2.2±0.26，與單干擾組及空白組相比均具有顯著差異（ P<0.05），聯(lián)合干擾組與Dual-shRNA組之間無(wú)

5、顯著差異。（3）QPCR檢測(cè)結(jié)果，各干擾組中 UL27和 UL54 mRNA表達(dá)水平均有不同程度降低，聯(lián)合干擾組抑制率為85.3±1.53%和81.3±6.51%；Dual-shRNA抑制率為84±1%和87.7±2.08%，分別與單干擾組及陰性對(duì)照組相比具有顯著差異（P<0.05），聯(lián)合干擾組與 Dual-shRNA組之間無(wú)顯著差異。UL27-shRNA組中UL27 mRNA表達(dá)抑制率為65.3±2.52%；UL54-shRNA組中U

6、L54 mRNA表達(dá)抑制率為71.6±3.51%，分別與空白對(duì)照組相比均有顯著差異（P<0.05）。（4）WB檢測(cè) gB和ICP27蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示各干擾組能不同程度降低靶基因蛋白表達(dá)量，雙干擾組中目的蛋白表達(dá)量明顯降低，與單干擾組相應(yīng)蛋白表達(dá)量相比具有顯著差異（P<0.05），聯(lián)合干擾組與Dual-shRNA組之間同一目的蛋白表達(dá)量無(wú)顯著差異。
　　結(jié)論：雙shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體能夠有效地抑制HSV-2目的基因表達(dá)；雙shR