lncRNA CCAT1在香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用及分子機制.pdf

1、肺癌作為惡性腫瘤之一，也是腫瘤相關(guān)死亡的首位死因，嚴(yán)重影響了人類健康和生活質(zhì)量，且目前仍缺乏有效預(yù)防和治療手段。而吸煙則是人類肺癌發(fā)生發(fā)展的首要危險因素，已有許多流行病學(xué)研究證實吸煙者的肺癌患病率顯著高于非吸煙者的肺癌患病率。盡管香煙煙霧能夠增加肺部疾病的患病風(fēng)險，但其誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化引起肺癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機制復(fù)雜且不易闡明。
　　最近有大量研究表明許多疾病的發(fā)生發(fā)展不僅與編碼蛋白的RNA有關(guān)，同時也與ncRNA的表達(dá)失調(diào)有關(guān)

2、。ncRNA中包括了最廣為人知的微小RNA(miRNA)以及最近被廣泛研究的長鏈非編碼RNA(lncRNA)和環(huán)狀RNA(circRNA)等。其中l(wèi)ncRNA是一類新興且目前研究較熱的大分子ncRNA，其長度超過200 nt，同時也可作為環(huán)境暴露的新的標(biāo)志物，很有可能在驅(qū)動暴露疾病關(guān)聯(lián)中發(fā)揮重要作用。有研究表明lncRNA通過與miRNA相互作用參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展，但關(guān)于lncRNA與miRNA相互作用在環(huán)境有害因素，特別是吸煙所致疾病

3、的發(fā)病機制中的作用研究較少。
　　目的：
　　探討長鏈非編碼RNA CCAT1(CCAT1)通過miR-218和let-7c在香煙煙霧抽提物(CSE)慢性處理所致HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的作用，從而揭示CSE所致HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的部分分子機制，為尋找吸煙所致肺損傷和肺癌的早期生物標(biāo)志提供科學(xué)線索。
　　方法：
　　一、香煙煙霧抽提物對HBE細(xì)胞lncRNA與miRNA水平的影響
　　用20μg/mL CS

4、E急性處理HBE細(xì)胞0、6、12或24 h，或慢性處理HBE細(xì)胞0、20、30或40代后，用RT-PCR實驗方法檢測細(xì)胞CCAT1、MALAT1、HOTAIR和H19的水平;用qRT-PCR實驗方法檢測細(xì)胞CCAT1、miR-21、miR-125a、miR-218和let-7c的水平。以觀察CSE對HBE細(xì)胞lncRNA與miRNA水平的影響。
　　二、香煙煙霧抽提物對HBE細(xì)胞BMI1水平的影響
　　分別用0或20μg/m

5、L CSE急性處理HBE細(xì)胞0、6、12或24 h后，或慢性處理HBE細(xì)胞0、20、30或40代后，Western blot檢測細(xì)胞BMI1水平。以觀察CSE對HBE細(xì)胞BMI1水平的影響。
　　三、CCAT1調(diào)控miR-218水平對香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞BMI1水平升高的影響
　　分別將pGL3-CCAT1-WT/pGL3-Ctrl與miR-218 mimic/Con mimic共轉(zhuǎn)染處理HBE細(xì)胞后，或用用100

6、ppm CCAT1 siRNA或Con siRNA預(yù)轉(zhuǎn)染處理HBE細(xì)胞后，或用50 nM miR-218 mimic或Con mimic轉(zhuǎn)染預(yù)處理HBE細(xì)胞24 h后，再使用0或20μg/mL CSE處理HBE細(xì)胞24 h，用熒光素酶報告基因?qū)嶒灧椒z測熒光素酶反應(yīng)強度;qRT-PCR檢測細(xì)胞CCAT1水平和miR-218的水平;Western blot檢測HBE細(xì)胞BMI1的水平。分別用100 ppm CCAT1 siRNA/Cons

7、iRNA與miR-218 inhibitor/Con inhibitor共轉(zhuǎn)染處理HBE細(xì)胞24 h后，再分別用0或20μg/mL CSE處理HBE細(xì)胞24 h，利用Westem blot檢測HBE細(xì)胞BMI1水平。以觀察C CAT1調(diào)控miR-218水平對CSE所致HBE細(xì)胞BMI1水平的影響。
　　四、CCAT1通過miR-218調(diào)控BMI1在香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用
　　分別用100 ppm CCA

8、T1 siRNA/Con siRNA與miR-218 inhibitor/Con inhibitor共轉(zhuǎn)染處理由CSE慢性處理所致惡性轉(zhuǎn)化HBE細(xì)胞(T-HBE)，或分別用50nMBMI1 siRNA或Con siRNA轉(zhuǎn)染處理T-HBE細(xì)胞，qRT-PCR檢測細(xì)胞miR-218的水平，Westem blot檢測細(xì)胞BMI1水平，軟瓊脂集落形成實驗觀察細(xì)胞惡性程度，Transwell實驗觀察細(xì)胞侵襲遷移能力。以觀察CCAT1通過miR-

9、218調(diào)控BMI1對CSE所致HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響。
　　五、香煙煙霧抽提物對HBE細(xì)胞c-Myc水平的影響
　　分別用0或20μg/mL CSE急性處理HBE細(xì)胞0、6、12和24 h，或慢性處理HBE細(xì)胞0、20、30和40代后，Western blot檢測細(xì)胞c-Myc水平。以觀察CSE對HBE細(xì)胞c-Myc水平的影響。
　　六、c-Myc在香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞CCAT1水平升高中的作用
　　分

10、別用50 nM c-Myc siRNA或Con siRNA轉(zhuǎn)染HBE細(xì)胞后，分別用0或20μg/mL CSE處理HBE細(xì)胞24 h，或分別用0或20μg/mL CSE急性處理HBE細(xì)胞24 h后，Western blot檢測細(xì)胞c-Myc水平，qRT-PCR檢測細(xì)胞CCAT1水平;ChIP實驗方法檢測HBE細(xì)胞c-Myc與CCAT1啟動子區(qū)結(jié)合情況。以觀察c-Myc在CSE所致HBE細(xì)胞CCAT1水平升高中的作用。
　　七、let

11、-7c在香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞c-Myc水平升高中的作用
　　將pmirGLO-c-Myc-3'UTR-WT/pmirGLO-Ctrl與let-7c mimic/Con mimic共轉(zhuǎn)染處理HBE細(xì)胞后，或用50 nM let-7c mimic或Con mimic轉(zhuǎn)染預(yù)處理HBE細(xì)胞24 h后，再使用0或20μg/mL CSE處理HBE細(xì)胞24 h，用熒光素酶報告基因?qū)嶒灧椒z測細(xì)胞熒光素酶反應(yīng)強度，qRT-PCR檢測細(xì)胞l

12、et-7c水平，Westernblot檢測細(xì)胞c-Myc水平。以觀察let-7c在CSE所致HBE細(xì)胞c-Myc水平升高中的作用。
　　八、CCAT1在香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞c-Myc水平升高中的作用
　　用100 ppm CCAT1 siRNA或Con siRNA預(yù)轉(zhuǎn)染處理HBE細(xì)胞后，或分別將pGL3-CCAT1-WT/pGL3-Ctrl與let-7c mimic/Con mimic共轉(zhuǎn)染處理HBE細(xì)胞后，再聯(lián)合0

13、或20μg/mL CSE處理HBE細(xì)胞24 h;分別用100ppm CCAT1 siRNA/Con siRNA與let-7c inhibitor/Con inhibitor共轉(zhuǎn)染處理HBE細(xì)胞24 h后，再分別用0或20μg/mL CSE處理HBE細(xì)胞24 h，qRT-PCR檢測細(xì)胞CCAT1和let-7c水平，Western blot檢測HBE細(xì)胞c-Myc水平;熒光素酶報告基因?qū)嶒灧椒z測熒光素酶反應(yīng)強度。以觀察CCAT1在香煙煙霧

14、抽提物所致HBE細(xì)胞c-Myc水平升高中的作用。
　　九、CCAT1通過let-7c與c-Myc相互調(diào)控在香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用
　　分別用100ppm CCAT1 siRNA/Con siRNA與let-7c inhibitor/Con inhibitor共轉(zhuǎn)染或分別用50 nM c-Myc siRNA或Con siRNA轉(zhuǎn)染處理T-HBE細(xì)胞，Westernblot檢測T-HBE細(xì)胞c-Myc水平;

15、軟瓊脂集落形成實驗觀察T-HBE細(xì)胞惡性程度;Transwell實驗觀察T-HBE細(xì)胞侵襲遷移能力。以觀察CCAT1通過let-7c與c-Myc相互調(diào)控對CSE所致HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響。
　　結(jié)果：
　　一、香煙煙霧抽提物對HBE細(xì)胞lncRNA與miRNA水平的影響
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)20μg/mL CSE急慢性處理引起HBE細(xì)胞CCAT1、MALAT1、HOTAIR、miR-21水平升高，let-7c和miR-218

16、水平下降，說明CSE引起HBE細(xì)胞CCAT1水平升高和miR-218和let-7c水平降低。
　　二、香煙煙霧抽提物對HBE細(xì)胞BMI1水平的影響
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)20μg/mL CSE急性處理6h或慢性處理20代后，HBE細(xì)胞BMI1水平顯著高于處理前或同代對照組HBE細(xì)胞，并有一定的時間-效應(yīng)關(guān)系。說明CSE處理可以引起HEB細(xì)胞BMI1水平升高。
　　三、CCAT1調(diào)控miR-218水平對香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞

17、BMI1水平升高的影響
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-218 mimic與pGL3-CCAT1-WT共轉(zhuǎn)染后聯(lián)合20μg/mL CSE處理組熒光素酶活性顯著低于單獨CSE處理組。通過siRNA下調(diào)CCAT1可阻滯CSE所致HBE細(xì)胞CCAT1和BMI1水平升高及miR-218水平降低;上調(diào)miR-218可阻滯CSE所致HBE細(xì)胞BMI1水平升高;與單獨下調(diào)CCAT1聯(lián)合CSE處理組相比，同時下調(diào)CCAT1和let-7c后聯(lián)合CSE處理HBE

18、細(xì)胞組的BMI1水平顯著回升。說明CCAT1可能通過調(diào)控miR-218的表達(dá)影響其下游BMI1的水平。
　　四、CCAT1通過miR-218調(diào)控BMI1在香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單獨CSE處理HBE細(xì)胞組相比，通過siRNA下調(diào)CCAT1處理T-HBE細(xì)胞miR-218水平回升，同時BMI1水平下降，細(xì)胞集落形成數(shù)以及侵襲遷移細(xì)胞數(shù)顯著低于單純T-HBE細(xì)胞;而在下調(diào)CCAT1水平的基礎(chǔ)

19、上同時聯(lián)合下調(diào)miR-218處理T-HBE細(xì)胞后，BMI1水平顯著高于單獨下調(diào)CCAT1處理T-HBE細(xì)胞，細(xì)胞集落形成數(shù)和侵襲遷移細(xì)胞數(shù)顯著回升;下調(diào)BMI1后，T-HBE細(xì)胞的細(xì)胞集落形成數(shù)和侵襲遷移細(xì)胞數(shù)顯著下降。說明CCAT1通過miR-218調(diào)控BMI1影響了T-HBE細(xì)胞惡性程度和侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　五、香煙煙霧抽提物對HBE細(xì)胞c-Myc水平的影響
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)20μg/mL CSE急性處理6h或慢性處理20代

20、后，HBE細(xì)胞c-Myc水平顯著高于處理前或同代對照HBE細(xì)胞，并具有一定的時間．效應(yīng)關(guān)系。說明CSE處理引起HEB細(xì)胞c-Myc水平升高。
　　六、c-Myc在香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞CCAT1水平升高中的作用
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)20 gg/mL CSE處理組c-Myc和CCAT1水平顯著高于對照HBE細(xì)胞，通過siRNA關(guān)閉c-Myc可阻滯20μg/mL CSE所致HBE細(xì)胞c-Myc和C CAT1水平升高;20μg/mL

21、 CSE急性處理HBE細(xì)胞后c-Myc與CCAT1啟動子區(qū)結(jié)合增加。說明c-Myc在CSE所致HBE細(xì)胞CCAT1水平升高中具有重要作用。
　　七、let-7c在香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞c-Myc水平升高中的作用
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)let-7c可阻滯20μg/mL CSE所致HBE細(xì)胞c-Myc水平升高;let-7c mimic與pmirGLO-c-Myc-3'UTR-WT共轉(zhuǎn)染后聯(lián)合20μg/mL CSE處理組熒光素酶活

22、性顯著低于單獨CSE處理組。說明let-7c通過與c-Myc的3'-UTR區(qū)結(jié)合抑制CSE處理HBE細(xì)胞c-Myc的表達(dá)。
　　八、CCAT1在香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞c-Myc水平升高中的作用
　　結(jié)果顯示通過siRNA下調(diào)CCAT1可顯著阻滯20μg/mL CSE所致HBE細(xì)胞CCAT1和c-Myc水平升高;let-7c mimic與pGL3-CCAT1-WT共轉(zhuǎn)染后聯(lián)合20μg/mL CSE處理組熒光素酶活性顯著低

23、于單獨CSE處理組;CCAT1 siRNA和let-7c inhibitor聯(lián)合CSE處理組的c-Myc水平顯著高于單獨CCAT1 siRNA聯(lián)合CSE處理組，同時let-7c水平顯著下降。說明CCAT1可能通過與let-7c結(jié)合從而引起其下游c-Myc的水平變化。
　　九、CCAT1通過let-7c與c-Myc相互調(diào)控在香煙煙霧抽提物所致HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過siRNA下調(diào)CCAT1可使T-HBE細(xì)

24、胞c-Myc水平、細(xì)胞集落形成數(shù)和侵襲遷移細(xì)胞數(shù)顯著下降;而在利用siRNA下調(diào)CCAT1水平的基礎(chǔ)上聯(lián)合let-7c inhibitor處理T-HBE細(xì)胞后，c-Myc水平、細(xì)胞集落形成數(shù)和侵襲遷移數(shù)顯著高于單獨CCAT1 siRNA處理T-HBE細(xì)胞組。說明CCAT1可能通過let-7c調(diào)控c-Myc影響了T-HBE細(xì)胞的惡性程度和侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　結(jié)論：
　　1、CSE引起HBE細(xì)胞CCAT1水平升高及miR-218