肺炎克雷伯菌中floR基因的流行分布及質(zhì)粒特性的研究.pdf

1、目的：
　　研究臨床分離的肺炎克雷伯菌對氯霉素類藥物的的耐藥性及氯霉素抗性基因floR）在肺炎克雷伯菌中的分布及其在基因組的定位，探討floR基因相關(guān)可移動DNA元件的結(jié)構(gòu)及其水平轉(zhuǎn)移的分子機制，為有效防治耐藥性的形成和播散提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.以2010年～2014年間溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離的肺炎克雷伯菌為研究樣本，分析肺炎克雷伯菌對氯霉素類藥物（氯霉素、氟苯尼考）的耐藥情況。
　　2.

2、floR基因陽性菌株的篩查:通過PCR的方法來檢測327株肺炎克雷伯菌中floR基因的分布情況，PCR產(chǎn)物測序確定floR基因陽性菌株。
　　3.floR基因水平轉(zhuǎn)移能力及其所在質(zhì)粒的研究
　　(1)用肉湯法接合轉(zhuǎn)移試驗及克隆轉(zhuǎn)化試驗檢測floR基因的水平轉(zhuǎn)移能力，并對接合子和轉(zhuǎn)化子進行驗證，同時檢測氯霉素類藥物對接合子和轉(zhuǎn)化子的MIC值。
　　(2)挑取其中一株接合轉(zhuǎn)移成功的接合子，提取質(zhì)粒進行高通量測序，定位flo

3、R基因，確定質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。
　　4.floR基因陽性菌株間的同源性分析:通過脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gelelectrophoresis，PFGE)方法分析floR基因陽性菌株間的同源性，通過S1-PFGE方法分析floR基因陽性菌株質(zhì)粒的特性，研究floR基因陽性菌株的流行特征。
　　結(jié)果:
　　1.2010年～2014年溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床標(biāo)本中共分離到肺炎克雷伯菌327株，用瓊脂稀釋法檢測

4、肺炎克雷伯菌對氯霉素類藥物的MIC值:對氯霉素的耐藥率為34.6％;對氟苯尼考的耐藥率為19.0％。
　　2.PCR及測序確認23株肺炎克雷伯菌攜帶floR基因，陽性率為7.03％(23/327)，對氯霉素類藥物均表現(xiàn)出不同程度的耐藥。
　　3.克隆轉(zhuǎn)化試驗成功獲得23株floR基因陽性克隆菌株，其中22株克隆菌株對氯霉素類藥物均表現(xiàn)為耐藥性增高，只有一株克隆菌株表現(xiàn)為對氟苯尼考和氯霉素的敏感性升高;肉湯法接合轉(zhuǎn)移試驗成功獲

5、得3株oR基因陽性接合子，接合子對氯霉素類藥物的耐藥性增高。
　　4.floR基因所在質(zhì)粒的研究:對其中一株接合轉(zhuǎn)移陽性菌株的攜帶floR基因質(zhì)粒進行測序分析，結(jié)果顯示該質(zhì)粒大小為137kb，其中floR基因的上下游序列均為轉(zhuǎn)座酶基因。
　　5.脈沖場凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)23株floR基因陽性的肺炎克雷伯菌中，有22個PFGE型，有兩株菌相似度＞80％，為同一個PFGE型。S1-PFGE結(jié)果發(fā)現(xiàn)，floR基因陽性的23株肺炎克雷

6、伯菌的質(zhì)粒圖譜相差很大，接合轉(zhuǎn)移成功的三株肺炎克雷伯菌，其中兩株為同一個PFGE型，而這兩株菌的接合子的S1-PFGE結(jié)果顯示接合子質(zhì)粒條帶相似，但是定位floR基因是否位于這個質(zhì)粒上還需要做進一步的Southern Blot來驗證。
　　結(jié)論:
　　1.高通量測序技術(shù)能使我們在短時間內(nèi)測定核酸序列，通過對質(zhì)粒序列進行分析來探索基因序列結(jié)構(gòu)與病原微生物耐藥性的關(guān)系，對于致病菌中耐藥基因的分布及新基因的發(fā)掘和功能研究起著極為有

7、效的作用，為新藥的研制開發(fā)提供了新的思路。
　　2.本地區(qū)臨床分離的肺炎克雷伯菌中檢測到floR基因，攜帶率為7.03％。
　　3.本研究中的floR基因定位于質(zhì)粒上，質(zhì)粒較大，攜帶有接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和多種耐藥基因，結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，可以通過接合轉(zhuǎn)移試驗進行水平轉(zhuǎn)移，形成耐藥性的播散。
　　4.本研究中23株floR基因陽性菌株中，有22個PFGE型，有兩株菌相似度＞80％，為同一個PFGE型，其余菌株相似度較低，揭示floR