免疫球蛋白對(duì)大鼠皮膚移植的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:皮膚是人體面積最大的免疫器官，能夠阻止外界有害物質(zhì)的侵入，同時(shí)，也是對(duì)任何病原體有效作用的第一道防線，跟外界形成了天然屏障。全層皮膚損傷的主要原因是皮膚損害、燒傷和難以愈合的潰瘍等，這是困擾著臨床的一個(gè)難以解決的問題。目前，主要的治療方法是皮膚移植，包括自體移植、同種異體移植和異種移植,從而使破損的皮膚最快愈合。但是,皮膚排斥仍然是移植重建的一個(gè)主要障礙。在1952年，人類第一次報(bào)道免疫球蛋白作為治療藥物使用,由Ogden

2、Bruton對(duì)一個(gè)與病史無關(guān)的持續(xù)嚴(yán)重感染性疾病的8歲男孩進(jìn)行治療。從那以后，免疫球蛋白被用于不同的疾病，其中包括：肺部、腎臟、心臟和肝臟移植等。免疫球蛋白(Ig)每年的需求正在穩(wěn)步增加,在過去15年里增加了兩倍，在2012年達(dá)到130公噸。但是,目前的治療方式主要以靜脈注射為主。由于靜脈注射并不適合所有患者(如：皮膚潰瘍損傷患者)，出于此原因,皮下注射免疫球蛋白(SCIG)將作為替代靜脈注射的另一種方式出現(xiàn)。
　　目前IgG作為

3、治療抑制皮膚移植術(shù)后排斥的藥物尚未見報(bào)道，本研究通過不同方式及劑量對(duì)移植皮膚大鼠進(jìn)行注射IgG，觀察大鼠皮瓣存活時(shí)間。并在移植皮瓣術(shù)后第4天，通過HE染色了解移植皮膚組織病理學(xué)變化，通過ELISA及QAR-CYT-3芯片檢測血液中相關(guān)細(xì)胞因子的水平，通過白細(xì)胞分類和肝腎功能檢查了解不同組別之間機(jī)體的炎癥反應(yīng)及毒性，通過流式細(xì)胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+和Foxp3+T細(xì)胞的數(shù)量。以期揭示IgG對(duì)皮膚移植最適宜的的劑量及用藥方式，

4、并試圖闡明其可能作用的機(jī)制。
　　材料與方法:
　　1、動(dòng)物模型制備及分組8～10周齡，雌雄各半,SPF級(jí)，體重250±10g,由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。經(jīng)腹腔注射麻醉并移植后，其中36只分為6組，分別皮下注射PBS及0.1、0.5、1、2、5mg IgG，觀察皮瓣的排斥情況。另外36只分為6組，分別尾靜脈注射PBS及0.1、0.5、1、2、5mg IgG，觀察皮瓣的排斥情況。剩余48只注射量為1mg IgG,根據(jù)注射方式不同，

5、隨機(jī)分為4組：PBS-Inj組（移植后，注射PBS），Intra-Inj組（移植后，腹腔內(nèi)注射1mg IgG），IvIg組（移植后，尾靜脈注射1mg IgG）, Sub-Inj組（移植后，移植部位皮下注射1mg IgG）。每組大鼠為12只，其中6只進(jìn)行皮瓣排斥時(shí)間觀察，6只大鼠在術(shù)后第4天進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測。另外，選擇6只正常大鼠，未進(jìn)行任何處理，作為各項(xiàng)指標(biāo)的正常對(duì)照。
　　2、尾靜脈及皮下注射不同劑量IgG的觀察通過注射IgG

6、后，用照相機(jī)記錄下每天不同組別皮瓣的排斥情況。
　　3、移植皮瓣的存活時(shí)間經(jīng)移植后，記錄下各組皮瓣的排斥時(shí)間。
　　4、病理學(xué)觀察移植4天后，由病理科醫(yī)師觀察各組移植皮膚的情況。
　　5、白細(xì)胞分類檢測皮膚移植4天后各組血液中淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的變化。
　　6、肝腎功能檢查檢測皮膚移植4天后各組血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酐及尿素氮的變化。
　　7、ELISA檢測

7、皮膚移植4天后各組血液中分泌細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ的水平。
　　8、QAR-CYT-3芯片檢測皮膚移植4天后各組血液中細(xì)胞因子B7-2b、NGF、CINC-1、CINC-2、CINC-3、CNTF、Fractalkine、GM-CSF、ICAM-1、IFNg、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、LIX、IL-13、L-Selectin、MCP-1、PDGF-AA

8、、Prolactin R、RAGE、TCK-1、TIMP-1、TNFa、VEGF的變化。
　　9、流式細(xì)胞儀檢測皮膚移植4天后各組血液中CD3+、CD4+、CD8+和Foxp3+T細(xì)胞的變化。
　　結(jié)果:
　　1、IvIg組及Sub-Inj組1mgIgG的皮瓣存活時(shí)間最長，且開始排斥的時(shí)間最晚；
　　2、從皮膚生存率曲線可見到，Sub-Inj組的皮膚耐受時(shí)間最長；
　　3、皮膚移植術(shù)后4d，根據(jù)病理情況，可

9、見到Sub-Inj組的移植皮膚排斥反應(yīng)最少；
　　4、皮膚移植術(shù)后4d，Sub-Inj組淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞明顯低于其他組；
　　5、皮膚移植術(shù)后4d，PBS-Inj組及Intra-Inj組的肝腎功能損害明顯比正常組、IvIg組及Sub-Inj組嚴(yán)重；
　　6、皮膚移植術(shù)后4d，通過ELISA檢測，Sub-Inj組IL-4及IL-10高于其他組；
　　7、皮膚移植術(shù)后4d，QAR-CYT-3芯片檢測Sub-Inj

10、組IL-1α、IL-2、L-Selectin、GM-CSF、B7-2、Fractalkine及ICAM-1低于其他組，Sub-Inj組IL-4、IL-10、MCP-1高于其他組；
　　8、皮膚移植術(shù)后4d，流式細(xì)胞儀檢測Sub-Inj組的CD3+細(xì)胞是比PBS-Inj組、Intra-Inj組及IvIg組減低，Sub-Inj組在CD4+/CD8+的細(xì)胞比例當(dāng)中比PBS-Inj組、Intra-Inj組及IvIg組升高；Sub-Inj組

11、和IvIg組的CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比PBS-Inj組、Intra-Inj組升高，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、IgG能使大鼠移植皮膚耐受時(shí)間延長，在不同的劑量當(dāng)中，無論是靜脈注射或者是皮下注射IgG，都是注射1mgIgG的皮瓣存活時(shí)間最長，且開始出現(xiàn)排斥的時(shí)間最晚。而注射0.1、0.5、2、5mgIgG都較早皮瓣就已經(jīng)排斥完畢。說明注射 IgG的劑量太少起不到作用，而太大可能加速了排斥

12、。
　　2、在不同的注射方式當(dāng)中，Sub-Inj組的皮膚耐受時(shí)間最長，效果最好，肝腎功能損害最小，其機(jī)制可能是：
　　1）由于CD4+CD25+Foxp3+Tregs細(xì)胞活躍的原因；
　　2）由于局部發(fā)生了抗原抗體免疫反應(yīng)，阻止了對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞及上皮組織等的損害，從而保護(hù)了移植皮膚的血管免受損害，使移植物的排斥時(shí)間延長；
　　3）在此過程中細(xì)胞因子IL-4、IL-10、MCP-1的活化，細(xì)胞因子IL-1α、IL-2、