TLRs與wnt-β-catenin信號通路在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖中的crosstalk.pdf

1、目的：研究TLRs的激活介導(dǎo)wnt/β-catenin信號通路活化，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖；同時(shí)探討TLRs在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用及其可能的機(jī)制。
　　方法：為了闡明TLRs活化對腫瘤的影響，通過體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29，檢測TLRs及wnt/β-catenin表達(dá)情況，通過過表達(dá)TLRs及siRNA等手段研究TLRs與wnt/β-catenin信號通路的相互關(guān)系，探討TLRs對wnt/β-catenin信號通路激活、促

2、進(jìn)結(jié)腸癌的生長及浸潤。1) LPS刺激結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29，隨后用RT-PCR檢測TLRs與Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平；2)LPS與順鉑聯(lián)合處理HT-29細(xì)胞，通過MTT方法檢測細(xì)胞增殖情況，繼而確定LPS及DDP的最適作用濃度及時(shí)間，建立TLRs活化對細(xì)胞耐受的藥物模型；3)按照藥物模型建立方法，給予細(xì)胞藥物處理后48h，RT-PCR及Western Blot檢測藥物模型中各組細(xì)胞wnt/β-cat

3、enin信號通路相關(guān)基因：wnt、β-catenin、P-GSK-3β表達(dá)變化，Toll樣受體及其相關(guān)炎性因子IL-6/TNF-α改變；4) NF-κB熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，按照藥物模型建立方法，給予細(xì)胞藥物處理，最后檢測模型中各組NF-κB的活化情況；5）siRNA抑制TLR4的信號通路后，Western Blot檢測wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因的改變。
　　結(jié)果：
　　1)RT-PCR結(jié)果顯示LPS刺

4、激HT-29細(xì)胞后TLRs（TLR1-10）表達(dá)發(fā)生了不同程度改變，其中TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9等TLRs表達(dá)出現(xiàn)不同程度的升高，且 TLR2、TLR4mRNA水平表達(dá)上調(diào)最為明顯；而Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因表達(dá)表現(xiàn)為： GSK-3β下調(diào)，WNT及β-catenin上調(diào);
　　2)MTT結(jié)果：不同濃度的LPS刺激HT-29細(xì)胞，對細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的抑制或者增殖作用，而當(dāng)同時(shí)給予不

5、同濃度DDP處理后，發(fā)現(xiàn)0.5μg/ml濃度的LPS，能有效的抵抗5μg/ml DDP對HT-29細(xì)胞的殺傷作用。根據(jù)上述結(jié)果建立0.5μg/mlLPS處理組、5μg/mlDDP處理組、陰性對照組、LPS聯(lián)合DDP處理組的藥物模型；
　　3）RT-PCR及Western Blot結(jié)果：藥物模型組中，與陰性對照組比較，LPS處理組p-GSK-3β表達(dá)下調(diào)，β-catenin表達(dá)上調(diào)，DDP組可抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)p-GSK-3β表達(dá)上

6、調(diào)，β-catenin表達(dá)下調(diào)，wnt/β-catenin信號通路被抑制；而聯(lián)合用藥組，wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因表達(dá)改變程度低于DDP組；同時(shí)，DDP組TLR2、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9、IL-6和TNF-α表達(dá)明顯下降，反映TLRs的活化受到抑制，而聯(lián)合用藥組TLRs表達(dá)下調(diào)程度明顯小于DDP組；
　　4） NF-κB熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示：LPS組相對熒光值明顯高于其它處理組，而DDP組相對熒

7、光值水平最低，聯(lián)合用藥組高于DDP組，提示LPS能通過激活NF-κB信號從而抑制順鉑引起的細(xì)胞凋亡4)siRNA抑制TLR4的信號通路后， P-GSK-3β表達(dá)升高，而β-catenin表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LPS能夠通過活化TLRs信號通路從而介導(dǎo)wnt/β-catenin通路的活化，從而干預(yù)順鉑引起的HT-29細(xì)胞凋亡；這些結(jié)果提示TLR4/NF-κB信號通路的活化，IL-6和TNF-a等炎性因子釋放，能夠介