轉(zhuǎn)染hTLR3基因的樹鼩肝細(xì)胞模型構(gòu)建研究.pdf

1、目的：通過對樹鼩肝細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)基因處理，將人Toll樣受體3（human Toll-like receptor，hTLR3）基因轉(zhuǎn)入樹鼩肝細(xì)胞中，建立hTLR3轉(zhuǎn)基因樹鼩肝細(xì)胞模型。該模型的建立將為開展 TLR3的作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和抗病毒作用機制研究、以及通過調(diào)節(jié)hTLR3表達(dá)進(jìn)行抗人乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）藥物的篩選奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　?。?）采用兩步膠原酶灌注的方法分離樹鼩原代肝

2、細(xì)胞，并與飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)的方式進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)。采用觀察細(xì)胞形態(tài)、糖原（PAS）染色及抗人細(xì)胞角蛋白18（cytokeratin18，CK-18）免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法對樹鼩原代肝細(xì)胞進(jìn)行綜合鑒定。
　　（2）采用PCR法擴(kuò)增hTLR3基因，將產(chǎn)物連接到慢病毒載體pLV中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pLV-hTLR3，并對重組質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR挑選和測序鑒定。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將 pLV-hTLR3重組質(zhì)粒與包裝包膜質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行pLV

3、-hTLR3載體的慢病毒包裝，收集病毒上清液，繼續(xù)感染293T細(xì)胞，經(jīng)多輪擴(kuò)增后測定重組慢病毒質(zhì)粒，進(jìn)行倍比稀釋檢測病毒滴度。
　　（3）將含hTLR3慢病毒載體的病毒液感染樹鼩原代肝細(xì)胞，制備樹鼩hTLR3轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞，通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的熒光表達(dá)以及分子生物學(xué)方法聯(lián)合進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果：
　?。?）一只樹鼩一般可獲得3.0×107個肝細(xì)胞，細(xì)胞存活率為85％±5%。肝細(xì)胞培養(yǎng)4h后開始貼壁，呈卵圓形。培

4、養(yǎng)24h后細(xì)胞貼壁完全，胞體明顯變大、平展生長，可見明顯的雙細(xì)胞核及三細(xì)胞核。培養(yǎng)48h后細(xì)胞相互連接，逐漸形成島嶼狀。顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)均一，經(jīng)PAS染色和抗CK-18染色，肝細(xì)胞胞質(zhì)分別被染成紫紅色和棕黃色，純度可達(dá)90%以上。
　　（2）對慢病毒包裝過程中的脂質(zhì)體劑量的摸索和四質(zhì)粒比例正交試驗，確立2.75μL劑量的脂質(zhì)體與四質(zhì)粒體系（載體質(zhì)粒、pGag/Pol、pR ev、pVSV-G）比例為10:7:3:3的最優(yōu)條件，進(jìn)行

5、病毒包裝，包裝出的慢病毒顆粒滴度為1.2×107TU/mL。
　?。?）慢病毒濃縮液成功感染樹鼩原代肝細(xì)胞，感染率約為60%。
　　結(jié)論：
　?。?）經(jīng)分離、純化、培養(yǎng)及鑒定，成功從樹鼩肝臟中獲取樹鼩原代肝細(xì)胞，為后續(xù)實驗奠定了細(xì)胞基礎(chǔ)。
　?。?）成功構(gòu)建攜帶hTLR3基因的慢病毒載體，包裝純化后得到的病毒可用于感染樹鼩原代肝細(xì)胞，為制作轉(zhuǎn)基因細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。
　?。?）經(jīng)初步鑒定成功構(gòu)建了hTLR3轉(zhuǎn)基