絕經(jīng)后甲狀腺結節(jié)的雌激素水平與雌激素代謝相關基因的表達.pdf

1、目的:甲狀腺結節(jié)是最常見的甲狀腺增生性疾病。流行病學調(diào)查顯示，甲狀腺結節(jié)的患病率女性比男性高4-5倍。體外細胞實驗也證明，雌激素可通過其受體α(ERα)或受體β(ERβ)促進細胞的增殖。因此，體內(nèi)的雌激素在甲狀腺結節(jié)的形成中可能發(fā)揮一定的作用。
　　然而，絕經(jīng)后女性與相同年齡階段的男性甲狀腺結節(jié)的發(fā)病率相似，且都隨年齡的增加而增加。此階段形成的結節(jié)與血清或甲狀腺結節(jié)局部的雌激素水平是否相關未見報道。
　　雌激素是一組低分子天

2、然固醇類激素，在人體內(nèi)有三種形式:雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)。其中，E2是活性最強的雌激素，是絕經(jīng)前婦女體內(nèi)主要的雌激素種類;2-甲基氧雌二醇(2ME2)與E1、E2、E3相比，對雌激素受體的親和力最低，并且有抑制增殖、促進凋亡的作用。甲狀腺中的雌激素既可來自血液也可原位合成。甲狀腺結節(jié)雌激素水平除了與攝取、合成相關外，還決定于雌激素在細胞內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化。17β羥固醇脫氫酶(HSD17B)是一類參與雌激素代謝的酶，其中，

3、 HSD17B1和HSD17B7催化E1向高活性的E2轉(zhuǎn)化;而HSD17B2、HSD17B4、HSD17B8和HSD17B14則催化E2向低活性E1的轉(zhuǎn)化。
　　為確定絕經(jīng)后女性全身和結節(jié)局部雌激素是否與甲狀腺結節(jié)形成有關，本實驗以絕經(jīng)后甲狀腺結節(jié)患者為研究對象，通過測定其血清、結節(jié)組織和結節(jié)旁組織中的E1、E2、2ME2水平，雌激素受體:ERα、ERβ、GPR30基因的表達水平，以及雌激素代謝相關酶:HSD17B1、HSD17B

4、2、HSD17B4、HSD17B7、HSD17B8、HSD17B14基因的表達，探討它們在甲狀腺增生性疾病中的作用，為預防和治療該類疾病提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1取材和分組
　　甲狀腺標本取材自河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院腺體外科2013年2月至9月手術切除的甲狀腺腫物。結節(jié)和結節(jié)旁組織(1)分別置于凍存管中，凍于-80℃冰箱，用于RNA的提取和E1、E2、2ME2的測定。(2)送病理科作病理診斷。根據(jù)病理結果，甲狀腺

5、結節(jié)組織為結節(jié)組;結節(jié)旁正常甲狀腺組織為對照組。采集甲狀腺腫物切除術前的患者空腹血清，用于甲狀腺功能以及E1、E2、2ME2的測定。
　　2甲狀腺功能的測定
　　采用放射免疫分析法(RIA)測定血清FT3、FT4濃度，用免疫放射法(IRMA)測定血清TSH濃度。
　　3甲狀腺組織和血清E1、E2和2ME2含量的測定
　　3.1甲狀腺組織勻漿的制備
　　甲狀腺組織用生理鹽水制備成1％的組織勻漿，用于蛋白質(zhì)、組

6、織E1、E2和2ME2的測定。
　　3.2甲狀腺組織中蛋白定量
　　以牛血清白蛋白為標準，用考馬斯-亮蘭法測定蛋白濃度，結果以mg/ml表示。
　　3.3甲狀腺組織和血清E1含量的測定
　　采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法進行測定。組織中的E1含量以每毫克樣本蛋白含有的E1表示(pg/mg pr);血清中E2含量以每毫升血清含有的E2表示(pg/ml)。
　　3.4甲狀腺組織和血清E2含量的測定
　　采用液相

7、平衡競爭放射免疫分析法測定。組織中的E2含量以每毫克樣本蛋白含有的E2表示(pg/mg pr);血清中E2含量以每毫升血清含有的E2表示(pg/ml)。
　　3.5甲狀腺組織和血清2ME2含量的測定
　　采用酶免疫法測定。組織中的2ME2含量以每毫克樣本蛋白含有的2ME2表示(pg/mg pr)。血清中2ME2含量以每毫升血清含有的2ME2表示(pg/ml)。
　　4 Real-time PCR
　　應用E.Z.

8、N.A.TM Total RNA KitⅡR6934-01試劑盒(OMEGA bio-tek)提取RNA。應用invitrogen公司的M-MLV First Strand Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(catno.C28025-032)對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。使用Bestar(R)SybrGreen qPCR mastermix(DBI Bioscience)試劑盒，對目的基因進行擴增?；虻南鄬Ρ磉_量用2(-ΔCt)表示。

9、r>　　5數(shù)據(jù)分析
　　實驗數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗，不符合正態(tài)分布，故計量資料采用中位數(shù)（最小值，最大值）表示，組間差異采用秩和檢驗分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。相關性使用Spearman秩相關分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1一般資料
　　32例絕經(jīng)后女性甲狀腺結節(jié)患者中，46～50歲6例，51～63歲26例。病理類型為單純結節(jié)性甲狀腺腫17例，結

10、節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤樣增生10例，結節(jié)性甲狀腺腫伴鈣化、纖維化、囊性變5例。甲狀腺功能正常的患者31例，甲狀腺功能亢進1例。
　　2絕經(jīng)后甲狀腺結節(jié)患者血清E2水平高于正常人
　　經(jīng)單樣本秩和檢驗，患者血清E2為58.87(40.21，114.62) pg/ml，高于絕經(jīng)后的正常人血清E2的最高值31pg/ml，P＜0.01。結果表明，絕經(jīng)后患甲狀腺結節(jié)的女性血清E2水平增高。
　　3甲狀腺組織中E1、E2、2ME2的含

11、量
　　3.1結節(jié)組甲狀腺的E2含量高于對照組
　　結節(jié)組E2的含量為3.17(1.30，10.21)pg/mg，高于對照組2.16(0.51，7.30) pg/mg，差異有統(tǒng)計學意義(Z=2.052，P＜0.05)，但與血清中的E2含量無相關性（結節(jié)組r=0.252，P=0.430;對照組r=0.282，P=0.401）。說明結節(jié)組織中E2的水平的升高與血液E2的升高無關，結節(jié)的形成可能與局部E2的高水平有關。
　　

12、3.2結節(jié)組甲狀腺的E1水平與對照組無差別
　　結節(jié)組E1的含量為25.05(11.76，104.56) pg/mg，對照組為18.62(6.37，86.89) pg/mg，差異無統(tǒng)計學意義（Z=1.127，P=0.260）。組織中E1的含量與血清中的E1含量無相關性（結節(jié)組r=0.865，P=0.067;對照組r=0.637，P=0.183）。說明甲狀腺組織中E1的含量與血液中E1的含量無關，結節(jié)組甲狀腺的E1含量與對照組無差別

13、。
　　3.3結節(jié)組甲狀腺的2ME2水平與對照組無差別
　　結節(jié)組2ME2的含量為3.52(1.42，13.82) pg/mg，對照組為2.87(0.78，9.11)pg/mg，差異無統(tǒng)計學意義（Z=1.851，P=0.064）。組織中的2ME2含量與血清中的2ME2含量無相關性（結節(jié)組r=0.533，P=0.139;對照組r=0.450，P=0.224）。說明甲狀腺組織中的2ME2含量與血液中的含量無關，結節(jié)組甲狀腺的2M

14、E2含量與對照組無差別。
　　4與雌激素代謝相關的基因mRNA表達
　　5.1結節(jié)組和對照組均表達與E2合成相關的基因
　　結節(jié)組HSD17B1 mRNA的表達水平為0.1566(0.01，7.10)，高于對照組0.09(0.01，4.52)，差異有統(tǒng)計學意義(Z=2.068，P＜0.05)。
　　HSD17B7 mRNA結節(jié)組的表達水平為9.11(1.08，60.63)，對照組為6.22(1.96，57.59)

15、，差異無統(tǒng)計學意義(Z=1.125，P＞0.05)。
　　上述結果表明，結節(jié)組E2水平的升高可能與HSD17B7 mRNA的表達無關，而與HSD17B1 mRNA表達升高有關。
　　5.2結節(jié)組和對照組均表達與E2失活相關的基因
　　HSD17B2 mRNA結節(jié)組表達水平為0.03(0.0004，1.09)，對照組為0.01(0.0003，1.64)，差異無統(tǒng)計學意義(Z=1.703，P＞0.05)。
　　HSD

16、17B4 mRNA結節(jié)組表達水平為7.68(1.74，62.34)，對照組為6.84(0.81，19.44)，差異無統(tǒng)計學意義（Z=1.399，P＞0.05）。
　　HSD17B8 mRNA病變組表達水平為57.29(5.29，149.82)，對照組為47.84(5.19，151.56)，差異無統(tǒng)計學意義(Z=0.274，P＞0.05)。
　　HSD17B14 mRNA病變組表達水平為11.05(2.38，90.56)，對照

17、組為12.52(0.72，140.63)，差異無統(tǒng)計學意義（Z=0.213，P＞0.05）。
　　上述結果表明，結節(jié)組E2水平的升高不是由于以上E2失活基因表達的降低造成的。
　　5.3結節(jié)組和對照組均表達雌激素受體基因
　　ERαmRNA結節(jié)組的表達水平為0.43(0.0057，49.8936)，高于對照組0.07(0.01，7.34)，差異有統(tǒng)計學意義（Z=2.062，P＜0.05）。
　　ERβmRNA結節(jié)

18、組表達水平為0.03(0.001，0.61)，對照組為0.02(0.003，0.27)，差異無統(tǒng)計學意義(Z=1.616，P＞0.05)。
　　GPR30 mRNA結節(jié)組表達水平為12.01(1.71，150.59)，對照組為13.70(0.47，33.61)，差異無統(tǒng)計學意義（Z=0.152，P＞0.05）。
　　上述結果表明，結節(jié)組E2通過ERα途徑介導的作用增強。
　　結論:
　　1絕經(jīng)后甲狀腺結節(jié)患者血清