HIV感染者血漿IDO與IFN-α的含量及其與T細(xì)胞活化的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：持續(xù)的T細(xì)胞活化是目前公認(rèn)的驅(qū)動HIV感染者疾病進展的一個主要因素，但導(dǎo)致T細(xì)胞持續(xù)活化的機制尚不清楚，成為艾滋病免疫致病機制中亟待闡明的關(guān)鍵問題。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)是人體免疫系統(tǒng)中功能最強的一種專職抗原呈遞細(xì)胞(Antigen presenting cells，APC)，作為天然免疫細(xì)胞能夠誘導(dǎo)天然免疫應(yīng)答，并在連接天然免疫和獲得性免疫中有重要的作用。樹突狀細(xì)胞是唯一能夠活化初始的T細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)

2、胞。DC主要分為類漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(Plasmacytoid dendritic cell，pDC)和髓樣樹突狀細(xì)胞(Myeloid dendriticcell，mDC)二個亞群。pDC是樹突狀細(xì)胞的一個重要亞群，連接天然免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，在病毒刺激下能夠產(chǎn)生大量的IFN-α，IFN-α可以限制HIV的感染，發(fā)揮直接的抗病毒活性。然而大量的證據(jù)顯示，HIV感染者IFN-α活性增加也是持續(xù)免疫活化和免疫功能缺陷的一個原因。在HI

3、V感染過程中外周循環(huán)pDC數(shù)量減少且功能缺陷，經(jīng)過有效的抗病毒治療也不能完全恢復(fù)。在急性和慢性HIV感染者中，由于HIV誘導(dǎo)pDC高度活化，盡管循環(huán)中pDC數(shù)量減少，IFN-α的產(chǎn)生卻明顯增加。那么，在AIDS疾病進展過程中，IFN-α發(fā)揮了有益的作用還是有害的作用？體外研究顯示，被HIV活化的pDC能夠產(chǎn)生吲哚胺2，3-二氧化酶（Indoleamine2，3-dioxygenase，IDO），正常情況下，IDO低水平表達，而在炎癥或感

4、染過程中其表達明顯增加。IDO具有很強的抑制T細(xì)胞增殖的作用，在IDO的作用下初始CD4+T細(xì)胞分化成具有抑制免疫應(yīng)答作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)。此外，pDC通過提呈抗原給T細(xì)胞，刺激T細(xì)胞活化，發(fā)揮適應(yīng)性免疫反應(yīng)?；罨腡細(xì)胞能夠促進pDC表達IDO，IDO通過降解局部色氨酸從而誘導(dǎo)對外源性的抗原耐受，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和致免疫耐受功能?？扇苄訡D14(soluble CD14，sCD14)是天然免

5、疫系統(tǒng)中的一個重要組成部分，是單核細(xì)胞活化的標(biāo)志物，也是微生物移位的標(biāo)志物，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。國外有研究報道，HIV感染者血清sCD14水平升高且與病情發(fā)展及病死率有關(guān)。CD40配體(CD40 Ligand，CD40L)主要表達于活化的T淋巴細(xì)胞表面，CD40L從活化的T細(xì)胞上脫落進入外周血稱可溶性CD40L(sCD40L)。在慢性HIV感染中，sCD40L能夠誘導(dǎo)DC表達IDO，同時也能夠抑制pDC產(chǎn)生IFN-α，促進免疫

6、活化。IDO通過誘導(dǎo)色氨酸分解代謝導(dǎo)致Th17/Treg比率失衡，有利于微生物移位。有研究顯示，在HIV急性和慢性的感染者中，外周pDCs中IFN-α mRNA表達增加，并且血清中IFN-α水平顯著升高。也有研究報道，HIV感染者經(jīng)過有效的ART治療后與未經(jīng)ART治療者比較，血漿IFN-α無顯著變化。所以我們檢測HIV感染不同時間血漿IFN-α水平，明確HIV感染不同時間血漿IFN-α含量。有文獻報道，HIV感染者外周血單個核細(xì)胞、扁桃

7、體、淋巴結(jié)等組織中IDO mRNA表達增加，但有關(guān)HIV感染者血漿IDO水平尚未見報道;也有文獻報道，血漿sCD40L、sCD14水平升高，并且sCD40L水平與T細(xì)胞活化表面標(biāo)志呈正相關(guān)。國內(nèi)外研究顯示，HIV感染者T細(xì)胞活化是一個多種因素參與的復(fù)雜過程，參與T細(xì)胞活化的血漿多種可溶性分子可能有多種。目前尚未見有關(guān)HIV感染者血漿IDO、IFN-α、sCD14水平與T細(xì)胞活化水平的相關(guān)性的報道。最近提出的HIV感染者免疫活化假說也提示

8、體內(nèi)T細(xì)胞活化在不同時間水平不同，因此提示我們要研究不同時間的IFN-α、IDO與T細(xì)胞活化關(guān)系。本文以HIV感染6個月內(nèi)、1-2年，HAART治療6個月、治療1-2年者為研究對象，檢測其血漿中IFN-α、IDO含量與CD4+T細(xì)胞、CD8+T活化水平，揭示IDO、IFN-α、sCD40L、sCD14含量與T持續(xù)細(xì)胞活化的相關(guān)性，對進一步闡明HIV感染疾病的致病機制有重要作用并為HIV的免疫治療提供依據(jù)。
　　方法：⑴選取HIV感

9、染者血漿共77例，根據(jù)感染及治療時間對其進行分組，其中HIV感染6個月內(nèi)者28例，HIV感染1-2年者18例，入選標(biāo)準(zhǔn):未接受HAART治療，感染時間6個月內(nèi)、1-2年者。HIV感染者治療6個月13例，HIV感染者治療1-2年者18例，入選標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)過嚴(yán)格的HAART治療6個月、1-2年者。77例HIV感染者均來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院紅絲帶門診，經(jīng)免疫印跡試驗確認(rèn)為陽性，平均年齡為27.3（27.3±6.74）歲。健康對照組(Heal

10、thy Control，HC)22例，平均年齡28(22.5±3.35)歲，入選標(biāo)準(zhǔn):HIV抗體陰性，血常規(guī)及肝腎功正常，乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗體陰性，無免疫系統(tǒng)疾病，未暴露于HIV的正常人。納入本課題研究的所有患者均簽署了知情同意書，并通過了中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。⑵CD4+T細(xì)胞絕對值的檢測。將20μl BD公司CD4/CD8/CD3 TriTEST試劑分別加入絕對計數(shù)管中，逆向加入50μl混勻的抗凝全血，室

11、溫避光染色15分鐘，加入1×兔洗溶血素450μl，室溫避光溶血15分鐘，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀及MultiSET軟件檢測并分析得到CD4+T淋巴細(xì)胞的絕對值。⑶HIV病毒載量測定。取1ml EDTA抗凝血漿，采用Roche公司COBAS(@)AmpliPrep(@)/COBAS(@) TaqMan(@)System自動載量儀上以實時熒光定量PCR方法測定病毒載量。全部操作按照操作說明書進行。⑷檢測血漿中IDO，IFN-α

12、，sCD14，sCD40L。稀釋血漿樣本（sCD14稀釋200倍，其余原倍），配制洗液、標(biāo)準(zhǔn)品、抗體、生物素。用ELISA kit檢測IDO, IFN-α, sCD14, sCD40L濃度[IDO(cusabio), IFN-α(ebioscience), sCD40L(ebioscience)，sCD14(R&D system)]按照說明書方法進行檢測。⑸統(tǒng)計學(xué)分析。應(yīng)用SPSS17.0和G-raphPad5.0軟件包進行統(tǒng)計分析和圖

13、形制作，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)表示，用方差分析(one-way AVOVA)進行不同組間的均值比較。不符合正態(tài)分布的用中位數(shù)表示。組間的比較采用T檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：①HIV感染未經(jīng)HAART治療者血漿中IDO、sCD40L含量增加;IFN-α、sCD14含量無顯著變化。HIV感染≤6個月和HIV感染1-2年未經(jīng)HAART治療者血漿中IDO、sCD40L含量顯著

14、高于健康對照組(P=0.0008，P=0.0007;P=0.0001，P=0.0032);而IFN-α、sCD14表達與健康對照組無顯著差異。②HIV感染者經(jīng)HAART治療后血漿中IDO、sCD40L含量顯著降低(P=0.0252，P=0.003);IFN-α含量無顯著變化，sCD14含量顯著高于健康對照組和未治療患者組(P=0.0015，P=0.0113)。③HIV感染不同時間血漿IDO、IFN-α、sCD40L、sCD14相關(guān)性。H

15、IV感染者血漿中IDO與IFN-α、sCD14無相關(guān)性;HIV感染≤6個月未經(jīng)HAART治療者血漿中IFN-α與sCD14呈正相關(guān)(P=0.03，r=0.4651);HIV感染1-2年未經(jīng)HAART治療者血漿中IDO與sCD40L呈正相關(guān)(P=0.0412，r=0.4853);HIV感染經(jīng)HAART治療1-2年者血漿中IDO與sCD40L呈正相關(guān)(P=0.0254，r=0.5245)。④HIV感染未經(jīng)HAART治療者T細(xì)胞活化水平增加。

16、感染≤6個月者外周血中CD38+CD4+T細(xì)胞、CD38+HLA-DR+CD4+T細(xì)胞、CD38+CD8+T細(xì)胞、HLA-DR+CD8+T細(xì)胞、CD38+HLA-DR+CD8+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著高于健康對照(P=0.0003，P=0.017，P＜0.0001，P=0.0002，P＜0.0001);感染1-2年者外周血中 CD38+CD4+T細(xì)胞、HLA-DR+CD4+T細(xì)胞、CD38+HLA-DR+CD4+T細(xì)胞、CD38+CD8+T細(xì)胞

17、、HLA-DR+CD8+T細(xì)胞、CD38+HLA-DR+CD8+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著高于健康對照(P＜0.0001，P=0.0241, P＜0.0001, P＜0.0001, P＜0.0001, P＜0.0001)。⑤HIV感染未經(jīng)HAART治療者血漿IDO、sCD40L與T細(xì)胞活化呈正相關(guān)。感染≤6個月者血漿中IDO的含量與T細(xì)胞活化呈正相關(guān)(P=0.057，r=0.5849)。感染1-2年者血漿中sCD40L含量與T細(xì)胞活化呈正相關(guān)(P

18、=0.0353，r=0.5648)。⑥HIV感染者血漿IDO、IFN-α、sCD40L、sCD14與CD4+T細(xì)胞、病毒載量相關(guān)性。HIV感染≤6個月未經(jīng)HAART治療者血漿中sCD14的含量與CD4+T細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)(P＜0.0001，r=-0.8913)，而IDO、IFN-α、sCD40L與CD4+T細(xì)胞數(shù)量無相關(guān)性;HIV感染1-2年未經(jīng)HAART治療者血漿中IDO的含量與CD4+T細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)(P=0.021，r=-0.5