15個STR基因座多態(tài)性及其在降解檢材分型檢驗中的應(yīng)用研究.pdf

1、短串聯(lián)重復(fù)序列(STR，short tandem repeats)或稱微衛(wèi)星DNA重復(fù)序列(microsatellite)是廣泛存在于人類基因組中的一類具有長度多態(tài)性的DNA序列，已廣泛應(yīng)用于遺傳制圖、遺傳連鎖性分析、親子鑒定、疾病基因定位和物種多態(tài)性研究、組織移植評價等諸多領(lǐng)域。STR分析技術(shù)的迅速發(fā)展，使其在法庭科學(xué)領(lǐng)域中的作用也愈來愈大，尤其是熒光標(biāo)記STR復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)和全自動DNA測序儀的結(jié)合使STR分析結(jié)果數(shù)字化、標(biāo)準(zhǔn)化，且一

2、次擴(kuò)增可多達(dá)16個基因座，累積個體識別力達(dá)到DNA指紋的認(rèn)定水平。STR檢驗極大地拓寬了法醫(yī)物證檢驗范圍，直接推動了DNA犯罪信息數(shù)據(jù)庫的發(fā)展。已成為法庭科學(xué)最直接、最重要的物證鑒定手段。每年就有數(shù)以萬計的DNA鑒定結(jié)論被法庭采用，在打擊犯罪中發(fā)揮越來越重要的作用。 盡管熒光標(biāo)記STP復(fù)合擴(kuò)增及其在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用自1999年開始已有報道，目前該技術(shù)已成為我國法醫(yī)物證檢驗的主導(dǎo)技術(shù)，并成功地應(yīng)用于各種案件的鑒定。但不管是基礎(chǔ)研究還

3、是實際應(yīng)用，都還有許多方面有待進(jìn)一步研究，表現(xiàn)在： 1．群體多態(tài)性：多態(tài)性頻率資料是準(zhǔn)確計算法醫(yī)學(xué)應(yīng)用參數(shù)、評估法醫(yī)學(xué)應(yīng)用效力的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。任何遺傳標(biāo)記在應(yīng)用于實際鑒定之前都必須對其進(jìn)行準(zhǔn)確的群體多態(tài)性調(diào)查研究。但我國有關(guān)不同人群STR基因座多態(tài)性頻率資料樣本量普遍較少，難以保證觀察樣本能夠代表該群體的基因頻率分布資料，且報道的頻率資料多為漢族人群，缺乏少數(shù)民族頻率資料，人群之間的差異性比較也不多。 2．家系分析：要分析

4、等位基因的傳遞是否遵循孟德爾分離律，觀察等位基因突變率，需要觀察500次以上減數(shù)分裂。我國應(yīng)用STR基因座作家系調(diào)查，家系數(shù)量普遍較少。 3．疑難生物檢材，特別是嚴(yán)重降解生物檢材多為一些成功的案例報道。如何發(fā)現(xiàn)、提取及分型檢驗，如何進(jìn)行質(zhì)量控制，一直是困擾國內(nèi)外法醫(yī)遺傳學(xué)者的棘手問題。如前處理方法、取材部位、DNA提取及純化方法，對STR能否分型十分重要。否則只能依賴后期檢驗，將降低現(xiàn)場檢材的應(yīng)用價值，對有效認(rèn)定犯罪，打擊犯罪十

5、分不利。 本研究從少數(shù)民族居住地隨機(jī)取樣，從樣本提取、基因座擴(kuò)增、檢測、分型到數(shù)據(jù)貯存及實際檢案均用同一條件，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及質(zhì)量控制；用目前擴(kuò)增基因座數(shù)目最多的。ldentifiler系統(tǒng)，準(zhǔn)確調(diào)查粵、桂、瓊地區(qū)漢族及12個少數(shù)民族STR基因座多態(tài)性，計算個體識別力、非父排除率、多態(tài)信息含量、親權(quán)概率等重要的法醫(yī)學(xué)參數(shù)；通過進(jìn)行實時定量和分型效果比較，對如何從現(xiàn)場提取腐敗白骨化檢材，如何進(jìn)行DNA提取純化和STR分型檢驗進(jìn)行了系統(tǒng)

6、研究；并建立了3個熒光標(biāo)記mini-STR復(fù)合擴(kuò)增體系。 主要成果如下： 1．首次對粵桂瓊地區(qū)漢族、壯族、瑤族、苗族、彝族、回族、京族、水族、毛南族、仫佬族、仡佬族、侗族和海南黎族等13個民族人群15個STR基因座進(jìn)行系統(tǒng)的頻率調(diào)查。通過13個人群共6690份樣品進(jìn)行15個STR基因座的分型檢測，共檢出191個等位基因，其中等位基因最多的是FGA，群體中最多達(dá)25個，最少的是TPOX，群體中最少僅8個。通過計算CODIS

7、系統(tǒng)13個STR基因座(D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、CSFlPO、TPOX、TH01、VWA、FGA)的累積偶合率介于3.65×10<'-15>～3.06×10<'-14>、累積非父排除率(三聯(lián)體)介于0.999961～0.999993、累積非父排除率(二聯(lián)體)介于0.9986～0.9992，Identifiler系統(tǒng)的全部15個STR基因座(C

8、ODIS系統(tǒng)13個STR基因座+D2S1338、D19S433)累積偶合率介于7.20×10<'-18>～2.88×10<'-16>、累積非父排除率(三聯(lián)體)介于0.9999952～0.9999989、累積非父排除率(二聯(lián)體)介于0.99962～0.99984。2．將調(diào)查得到的13個人群15個STR基因座基因頻率資料與其他群體比較，發(fā)現(xiàn)調(diào)查的13個人群與中國陜西、潮汕、江蘇、吉林、北京、四川、臺灣等人群差異很小，而與韓國、日本人群差異較

9、大，與莫桑比克黑人和美國白人的差距最大。這說明中華民族的不同民族間，由于戰(zhàn)亂、通婚、自然災(zāi)害等遷移，不同民族間差異明顯小于國外其他民族，而且作為系統(tǒng)比較，各民族間15個STR系統(tǒng)總個體識別力并無顯著差異。但不同民族間均有一些基因座頻率資料有顯著差異。因此，須以不同民族、不同群體的基因頻率資料計算法醫(yī)學(xué)應(yīng)用參數(shù)，判斷其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。 3．通過對所測樣本中檢出Ladder以外的等位基因的樣品進(jìn)行了單基因座擴(kuò)增和測序，檢出目前國內(nèi)尚

10、未見報道的一些罕見等位基因，如：TH01基因座的等位基因4，D21S11基因座的等位基因30.3、32.1和33.1，D18S51基因座的等位基因15.2和27，D7S820基因座的等位基因9.1和12.1，VWA基因座的等位基因11.1，F(xiàn)GA基因座的等位基因13和30。發(fā)現(xiàn)VWA、D18S51、CSFlPO、D7S820有3個等位基因各一次。這些基因的分布頻率很低(P<0.005)，在親子鑒定和個體識別中有重要意義。 4．對

11、15個STR基因座的突變率及突變本質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)研究。通過觀察15個STR基因座3184次基因傳遞，發(fā)現(xiàn)63個突變，涉及所有STR基因座，突變率在0.031％～0.22％之間，平均突變率為0.132％，各等位基因突變率為0～6.635％，不同基因座、不同等位基因間均存在明顯差異。未發(fā)現(xiàn)達(dá)到或超過3個基因座的突變，僅1個家系出現(xiàn)2個基因座突變。提示：用STR技術(shù)作親權(quán)鑒定須有3個基因座不符合孟德爾遺傳規(guī)律才可排除親生關(guān)系。 5．對1

12、5個STR基因座在DNA數(shù)據(jù)庫中的應(yīng)用效能進(jìn)行了比較研究。CODIS系統(tǒng)13個基因座在所調(diào)查的不同民族均具有高度多態(tài)性，符合法醫(yī)DNA檢驗基本條件，可作為我國DNA數(shù)據(jù)庫建設(shè)的基因座。Identifiler系統(tǒng)的另2個基因座 D2S1338、D19S433多態(tài)性較高，可作為DNA數(shù)據(jù)庫備選基因座，檢測結(jié)果也可入庫。根據(jù)。DP值所選的CODIS系統(tǒng)13個基因座中多態(tài)性最差的6個基因座(CSFlPO、TPOX、TH01、D3S1358、：D

13、7S820、D16S539)，9個基因座(上述6個加D13S317、D5S818和VWA)。6個STR基因座的累積偶合率介于3.29x10<'-6>～8.84×10<'-6>、累積非父排除率(三聯(lián)體)介于0.9514～0.9841、累積非父排除率(二聯(lián)體)介于0.8695～0.8997，9個STR基因座的累積偶合率介于1.40×10<'-9>～5.46×10<'-9>、累積非父排除率(三聯(lián)體)介于0.9946～0.9992、累積非父排除

14、率(二聯(lián)體)介于0.9707～0.9797。顯示，任意6個STR基因座入庫比對作個體識別，任意9個STR基因座入庫做親權(quán)鑒定會影響數(shù)據(jù)庫的效能。6．對現(xiàn)場提取的腐敗組織檢材進(jìn)行了系統(tǒng)研究。通過對毛發(fā)、指甲、軟骨、白骨等共240份檢材的前處理方法、取材部位、DNA提取純化方法、DNA定量及STR分型結(jié)果進(jìn)行比較研究?？梢娊⒌姆椒ú僮餍詮?qiáng)、效果良好。結(jié)果表明，磁珠法對降解檢材的分型成功率優(yōu)于Chelex-100法，檢出率依次為軟骨、指甲和

15、白骨。且指甲后段效果優(yōu)于前段，長骨骨密質(zhì)結(jié)果優(yōu)于骨松質(zhì)，毛發(fā)不宜作為白骨化P體STR分型常規(guī)檢材。將本方法應(yīng)用于實際案例512宗，9個STR基因座以上分型成功率可達(dá)93.33％。 7．建立了三個miniSTR復(fù)合擴(kuò)增體系。體系1包含CSFlPO、TPOX、TH01和Amelogenin基因座；體系2包含D8S1179、D16S539、D5S818基因座：體系3包含D13S317、D7S820、VWA基因座。建立了第二、第三個mi

16、niSTR復(fù)合擴(kuò)增體系同步擴(kuò)增方法，通過對第二個體系正向引物的5’端進(jìn)行熒光標(biāo)記、第三個體系用熒光素和生物素分別標(biāo)記正向和反向引物的5'端，將親和素連接于磁珠上，應(yīng)用鏈霉親和素磁珠使兩個復(fù)合擴(kuò)增體系的PCR產(chǎn)物得到有效分離。顯示miniSTR復(fù)合擴(kuò)增體系可以更有效地應(yīng)用于降解檢材的STR分型。建立的miniSTR復(fù)合擴(kuò)增體系特異性好，靈敏度高，具有良好的數(shù)據(jù)庫兼容性，對降解 DNA樣品的STR分型有效，具有良好的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。