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文檔簡介
1、急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是臨床常見急腹癥,具有起病急、病情重、變化快等特點,除了胰腺本身病變之外,還可能引起胰腺外器官和組織的損傷,甚至最終誘發(fā)全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)、多器官功能障礙綜合征(multiple-organ dysfunction syndrome,MODS)等而導致死亡。盡管在過去的幾十年里急性胰腺炎的研
2、究取得明顯進展,但是其發(fā)病機制仍較復雜。急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)無論病因如何,損傷的胰腺會引起胰酶的自身消化,同時作為炎癥刺激物刺激單核巨噬細胞及胰腺腺泡細胞釋放炎癥介質和細胞因子,觸發(fā)炎癥介質形成瀑布樣級聯(lián)反應,最終會導致局部或全身炎癥反應。CUEDC2(CUE domain-containing2)是一種含有CUE結構域的多功能蛋白質,廣泛在人類組織和器官中表達。大量研究表明,CUEDC2可以作用于多
3、種細胞內信號轉導通路,參與許多細胞活動,如細胞周期的調節(jié),生長信號因子的轉導、腫瘤的發(fā)生發(fā)展及炎癥反應。目前研究發(fā)現(xiàn)CUEDC2不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關,如乳腺癌、結腸炎相關性腫瘤、肺癌等,還可以參與炎癥反應,如結腸炎等。關于CUEDC2與急性胰腺炎的炎癥反應中的關系尚未有研究報道。本研究擬初步探討CUEDC2在急性胰腺炎中的作用。
目的:本研究通過雨蛙素誘導AR42J細胞建立急性胰腺炎細胞模型,并利用質粒轉染技術過表達C
4、UEDC2。監(jiān)測細胞培養(yǎng)液中淀粉酶(amylase,AMY)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的水平,初步探討CUEDC2對急性胰腺炎腺泡細胞TNF-α、IL-6的影響。
方法:
1.應用雨蛙素誘導AR42J細胞建立急性胰腺炎細胞模型。
2.獲得過表達 CUEDC2的AR42J細胞:采用脂質體轉染法將CUE
5、DC2質粒轉入AR42J細胞中,應用熒光顯微鏡查看轉染效率。
3.實驗分組:
AR42J細胞分為4組:陰性質粒對照組(Neg-Control組)、陰性質粒雨蛙素組(Neg-CAE組)、CUEDC2質粒對照組(CUEDC2-Control組)、CUEDC2質粒雨蛙素組(CUEDC2-CAE組)。具體分組方法如下:
陰性質粒組:應用陰性質粒轉染AR42J細胞。Neg-CAE組給予10-7 mol/L雨蛙素,Ne
6、g-Control組給予等體積完全培養(yǎng)基,再將兩組分為3個亞組:4h、8h、24h。
CUEDC2質粒組:應用 CUEDC2質粒轉染 AR42J細胞。CUEDC2-CAE組給予10-7 mol/L雨蛙素,CUEDC2-Control組給予等體積完全培養(yǎng)基,再將兩組分為3個亞組:4h、8h、24h。
4.CUEDC2測定:PCR檢測CUEDC2 mRNA的表達。western-blot檢測CUEDC2蛋白的表達。
7、> 5.淀粉酶、TNF-α、IL-6測定:應用淀粉酶試劑盒檢測細胞上清中淀粉酶(amylase,AMY)水平,應用ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)方法檢測細胞培養(yǎng)上清中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)水平。
6.統(tǒng)計學方法:應用SPSS21.0軟件包進行統(tǒng)計學處理,P<0.05
8、認為具有統(tǒng)計學意義。
結果:
1.成功建立了急性胰腺炎細胞模型,雨蛙素組 AMY的水平隨時間延長而增高且均較對照組升高(P<0.05)。雨蛙素組中CUEDC2mRNA水平較對照組下降(P<0.05)。雨蛙素組中各個時間點的CUEDC2mRNA無明顯變化(P>0.05);
2.應用CUEDC2質粒轉染細胞后,可見綠色熒光顆粒,細胞生長狀態(tài)良好,表明轉染條件穩(wěn)定,細胞轉染成功,轉染率約為65%-70%。CUED
9、C2質粒組CUEDC2蛋白水平較對照組升高(P<0.05)。陰性質粒組與對照組相比未見明顯差異(P>0.05);
3.細胞培養(yǎng)上清 AMY:各個時間點比較,在陰性質粒對照組和CUEDC2質粒對照組中AMY水平未見明顯上升,且兩組之間未見明顯差異(P>0.05);在各個時間點AMY水平,陰性質粒對照組和CUEDC2質粒對照之間無顯著差異(P>0.05)。在陰性質粒雨蛙素組和CUEDC2質粒雨蛙素組中AMY水平隨時間逐漸增高(P<
10、0.05)。陰性質粒雨蛙素組與 CUEDC2質粒雨蛙素組均較各自對照組升高(P<0.05);CUEDC2質粒雨蛙素組與陰性質粒雨蛙素組相比 AMY水平下降(P<0.05);
4.細胞培養(yǎng)上清TNF-α、IL-6:在陰性質粒對照組和CUEDC2質粒對照組中各個時間點TNF-α、IL-6水平較低,且兩組之間無統(tǒng)計學意義(P>0.05);在陰性質粒雨蛙素組和 CUEDC2質粒雨蛙素組中隨時間的延長 TNF-α、IL-6水平逐漸升高(
11、P<0.05)。陰性質粒雨蛙素組與CUEDC2質粒雨蛙素組在各個時間點TNF-α、IL-6水平均較各自對照組顯著上升(P<0.05);CUEDC質粒雨蛙素組與陰性質粒雨蛙素組相比,在各個時間點TNF-α、IL-6水平均降低(P<0.05)。
結論:
1.應用雨蛙素誘導可成功制備AP細胞模型。
2.在AP細胞模型中CUEDC2 mRNA的水平下調。
3.成功構建了過表達 CUEDC2蛋白的AP細胞模
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