組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300在ALAS2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用及組蛋白去乙?；敢种苿┒∷徕c激活A(yù)LAS2基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制.pdf

1、紅系特異的5-氨基酮戊酸合成酶(ALAS2)是紅系細(xì)胞血紅素生物合成的限速酶。ALAS2的缺失能導(dǎo)致紅細(xì)胞發(fā)育的停滯，ALAS2基因的遺傳性突變能引起x-連鎖的成高鐵紅細(xì)胞貧血(xLSA)。ALAS2基因的表達(dá)在紅細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中顯著增加以滿(mǎn)足血紅蛋白合成增加時(shí)對(duì)更多血紅素的需求。ALAS2基因的表達(dá)主要在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平被調(diào)控。 本論文用組蛋白去乙?；敢种苿┒∷徕c和TSA處理紅白血病細(xì)胞K562，反轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PC

2、R)和染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ALAS2基因轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，同時(shí)伴隨著ALAS2基因啟動(dòng)子組蛋白H4乙?；降纳摺hIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300能夠與ALAS2基因啟動(dòng)子結(jié)合。細(xì)胞轉(zhuǎn)染和報(bào)告基因分析結(jié)果顯示：p300在細(xì)胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)既能提高ALAS2基因啟動(dòng)子報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性，又能提高細(xì)胞內(nèi)源ALAS2基因mRNA水平。用p300的突變體p300△HAT(乙酰轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域缺失)代替p300重復(fù)

3、上述實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)p300乙酰轉(zhuǎn)移酶活性在激活A(yù)LAS2基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中是必要的。另外，我們還通過(guò)電泳遷移率(EMSA)實(shí)驗(yàn)確定ALAS2基因啟動(dòng)子上兩個(gè)新的Spl結(jié)合位點(diǎn)。報(bào)告基因染色質(zhì)免疫沉淀(reporter ChIP)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：P300和GATA-1共轉(zhuǎn)染細(xì)胞使ALAS2野生型基因啟動(dòng)子處的組蛋白H4乙?；缴撸瑢?duì)GATA-1位點(diǎn)突變的啟動(dòng)子組蛋白乙?；綗o(wú)明顯影響。位點(diǎn)突變體報(bào)告基因分析表明ALAS2基因啟動(dòng)子上的兩個(gè)GAT

4、A-1位點(diǎn)和所有的Spl位點(diǎn)都參與了p300的招募。我們的工作確定了ALAS2基因是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300／CBP的一個(gè)靶基因。 另一方面，我們研究了組蛋白去乙?；敢种苿┒∷徕c(NaBu)激活A(yù)LAS2基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)NaBu不僅能上調(diào)紅系細(xì)胞ALAS2基因的轉(zhuǎn)錄，而且能激活非紅系細(xì)胞ALAS2基因的轉(zhuǎn)錄。同時(shí)ALAS2基因啟動(dòng)子的組蛋白H3乙?；揭约敖M蛋白H3的第4位賴(lài)氨酸的雙甲基化水平升高。以啟動(dòng)子報(bào)告

5、基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后用含有NaBu的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，結(jié)果表明NaBu能以劑量依賴(lài)的方式增強(qiáng)ALAS2基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。以各種位點(diǎn)突變體報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，再用NaBu處理發(fā)現(xiàn)，任何一個(gè)Spl位點(diǎn)的突變都會(huì)不同程度地降低NaBu對(duì)ALAS2基因啟動(dòng)子的激活作用，當(dāng)所有的Spl位點(diǎn)都突變時(shí)，NaBu對(duì)ALAS2基因啟動(dòng)子的激活作用大大降低。因此，我們相信ALAS2基因啟動(dòng)子上的Spl位點(diǎn)是NaBu的應(yīng)答元件，即Spl位點(diǎn)至少部分地介導(dǎo)

6、了NaBu對(duì)ALAS2基因轉(zhuǎn)錄的激活。染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)。NaBu的處理能增加ALAS2基因啟動(dòng)子上Spl因子的結(jié)合。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：組蛋白去乙?；窰DACl能抑制ALAS2基因啟動(dòng)子的活性，它還能逆轉(zhuǎn)Spl和p300對(duì)ALAS2基因啟動(dòng)子的協(xié)同激活作用。ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ALAS2基因啟動(dòng)子上有：HDACl的結(jié)合，免疫共沉淀(CoIP)分析表明Spl和HDACl存在于同一復(fù)合物中。因此，我們認(rèn)為轉(zhuǎn)錄因子Spl能招募去乙?；窰

7、DACl抑制ALAS2基因的轉(zhuǎn)錄，推測(cè)HDAC抑制劑NaBu通過(guò)抑制HDACl的活性促進(jìn)ALAS2基因的轉(zhuǎn)錄。 總之，可逆的組蛋白乙?；揎梾⑴c了ALAS2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。紅系特異的轉(zhuǎn)錄因子GATA-1和遍在因子Sp1共同招募組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300，激活A(yù)LAS2基因的轉(zhuǎn)錄，Sp1還能招募組蛋白去乙酰化酶HDAC1抑制ALAS2基因的轉(zhuǎn)錄。p300活性和HDAC1活性的動(dòng)態(tài)平衡決定了ALAS2基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。 本論