脂多糖誘導(dǎo)矽肺患者肺泡巨噬細(xì)胞自噬體增多加重細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　矽肺是生產(chǎn)過(guò)程中長(zhǎng)期吸入游離SiO2粉塵引起的，以肺部廣泛的結(jié)節(jié)性纖維化為主的全身性疾病。矽肺是塵肺中最常見(jiàn)，危害最為嚴(yán)重的一種，其發(fā)生過(guò)程十分復(fù)雜。近年來(lái)我國(guó)矽肺發(fā)病形勢(shì)仍然十分嚴(yán)峻，在現(xiàn)有的矽肺研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究探討矽肺的發(fā)病機(jī)制依然具有很大的意義。
　　自噬(autophagy)是自噬體與溶酶體相結(jié)合降解細(xì)胞內(nèi)大分子和損傷細(xì)胞器的過(guò)程，自噬的主要功能是維持細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器降解代謝的平衡?；A(chǔ)自噬活動(dòng)對(duì)維持

2、細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡起著重要的作用。巨噬細(xì)胞的自噬活動(dòng)十分明顯，一直被研究者所熱衷。肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophage，AM)是SiO2作用的主要靶細(xì)胞，研究表明，肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡以及其釋放的促纖維化因子在肺纖維化的發(fā)生過(guò)程中扮演著重要的角色。自噬作為新的細(xì)胞程序性死亡方式，在肝纖維化、腎纖維化和心肌纖維化的過(guò)程中都發(fā)揮了重要的作用。同樣，我們?cè)谇捌诘膭?dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)自噬在矽肺纖維化的進(jìn)展中發(fā)生了變化，提示自噬可能也是

3、矽肺發(fā)生發(fā)展不可或缺的環(huán)節(jié)之一。但矽塵誘導(dǎo)AMs自噬的機(jī)制和自噬在AMs中的作用目前尚不清楚。
　　煤礦生產(chǎn)環(huán)境中存在著各種類型的革蘭氏陰性菌，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，而且LPS能夠誘導(dǎo)多種細(xì)胞如巨噬細(xì)胞自噬的發(fā)生，AMs在清除肺泡和肺間質(zhì)的粉塵和細(xì)菌方面發(fā)揮著重要的防御作用。研究表明，矽塵能夠降低肺泡巨噬細(xì)胞的殺菌能力。LPS是否能誘導(dǎo)矽肺AMs自噬的發(fā)生，以及LPS

4、是否能夠通過(guò)誘導(dǎo)自噬的發(fā)生影響矽肺的發(fā)病進(jìn)程，目前尚不清楚。本研究以矽肺患者為研究對(duì)象，收集其大容量肺灌洗液中的AMs，研究LPS對(duì)AMs自噬的作用及其機(jī)制，并探討AMs的自噬對(duì)矽肺發(fā)展的影響，以期在自噬層面為矽肺提供新的發(fā)病機(jī)制，并且為控制矽肺發(fā)病進(jìn)展提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:
　　一、研究對(duì)象的選擇
　　本研究選取了中國(guó)煤礦工人北戴河療養(yǎng)院53例男性接觸矽塵并且接受大容量肺灌洗患者，通過(guò)患者的接塵性質(zhì)以及X線片上的

5、結(jié)節(jié)病理改變來(lái)確定所研究的患者都是以矽肺病變?yōu)橹鳌Ｑ芯窟x取了11例觀察對(duì)象(Observer)，即患者在作業(yè)環(huán)境中接觸了粉塵，但是X線片并不能發(fā)現(xiàn)肺部有矽肺病變的改變，42例矽肺不同期別（Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期）的患者。通過(guò)調(diào)查表了解研究對(duì)象的基本情況，包括年齡、民族、工齡、接塵年齡等。矽肺病診斷由當(dāng)?shù)貕m肺病診斷小組根據(jù)我國(guó)《塵肺病診斷標(biāo)準(zhǔn)》(GBZ70-2009)進(jìn)行診斷。所有研究對(duì)象均排除與肺部相關(guān)的疾?。ㄈ绶伟顒?dòng)性肺結(jié)核等）及有塵肺

6、并發(fā)癥、嚴(yán)重心、肝、腎疾患以致不能進(jìn)行肺灌洗者。所有納入研究者肺灌洗前簽署知情同意書(shū)。
　　二、研究?jī)?nèi)容和方法
　?。ㄒ唬?、基本信息調(diào)查
　　根據(jù)課題研究目的設(shè)計(jì)合理的調(diào)查表，調(diào)查工作由本人直接負(fù)責(zé)，調(diào)查采用面對(duì)面問(wèn)卷式，調(diào)查研究對(duì)象的一般情況、職業(yè)史、接塵史、疾病史等。職業(yè)史資料來(lái)自肺灌洗者所在單位的勞資部門或職業(yè)病管理部門，塵肺診斷、肺灌洗情況以及肺部并發(fā)癥的資料來(lái)自北戴河療養(yǎng)院?？漆t(yī)院的住院病案。
　?。ǘ?/p>

7、）、巨噬細(xì)胞的分離、純化和培養(yǎng)
　　所有研究對(duì)象全麻下實(shí)施大容量肺灌洗，收集肺灌洗回收液，留取第一次肺灌洗液1ml。余下收集的肺灌洗液雙層無(wú)菌紗布過(guò)濾除去粘液后，離心，用PBS洗滌三次，每次1500 rpm離心10 min，細(xì)胞計(jì)數(shù)。取5×106 AMs加入盛有DMEM培養(yǎng)基的六孔培養(yǎng)板或細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37℃貼壁培養(yǎng)2h，更換培養(yǎng)基后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，留取上清，收獲細(xì)胞。AM培養(yǎng)24 h后，分別采用普通光學(xué)顯微鏡（瑞氏-吉姆薩染

8、色）、激光共聚焦顯微鏡（PI及抗人-CD68-FITC染色）觀察AMs形態(tài)特征和純化效果。
　?。ㄈ?、AMs自噬及其相關(guān)蛋白的檢測(cè)
　　AMs培養(yǎng)24 h后，分別采用Western Blotting法和免疫熒光法測(cè)定和觀察LC3的表達(dá)情況，采用透射電子顯微鏡觀察自噬體和溶酶體的形態(tài)和數(shù)量。采用Western Blotting測(cè)定SQSTM1/p62，LAMP2，調(diào)控自噬的相關(guān)信號(hào)蛋白BECN1/Beclin1，p-mTOR

9、，Toll樣受體4(TLR4)及其相關(guān)信號(hào)蛋白MyD88，TICAM1的表達(dá)。ECL熒光顯色，X光片曝光、定影，Image J圖像分析軟件做灰度分析，檢測(cè)條帶的平均光強(qiáng)度，計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。
　?。ㄋ模?、LPS對(duì)AMs自噬的調(diào)控分析
　　采用抗人的ELISA試劑盒測(cè)定肺灌洗液中LPS的表達(dá)水平。分別將6例觀察對(duì)象、Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期矽肺的AMs純化后，按照給予的處理分為3組:未處理組，LPS組，HTA125組。采用Wester

10、n Blotting檢測(cè)TLR4、MyD88、TICAM1、Beclin1、p-mTOR、SQSTM1/p62，LAMP2的表達(dá)。
　?。ㄎ澹?、自噬對(duì)LPS誘導(dǎo)AMs凋亡及炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響分析
　　分別將6例觀察對(duì)象、Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期矽肺的AMs純化后，按照給予的處理分為3組:未處理組，LPS組，LPS+3MA組。采用TUNEL法檢測(cè)各組AM的凋亡情況，采用抗人的ELISA試劑盒測(cè)定各組AM培養(yǎng)上清中炎性細(xì)胞因子IL-

11、1β、IL-8、TNF-α的表達(dá)水平，采用Western Blotting檢測(cè)Bcl-2、Bax、Caspase-3、NF-kB的表達(dá)。
　?。?、統(tǒng)計(jì)分析
　　資料整理后，用Excel建立數(shù)據(jù)庫(kù)，全部數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表示為mean±SD。采用單因素方差分析(ANOVA)比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，當(dāng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，用LSD進(jìn)行組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:

12、>　　一、矽肺患者AMs自噬活性增強(qiáng)
　　共聚焦顯微鏡下觀察，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組的AMs胞漿中比觀察對(duì)象組包含更多的LC3陽(yáng)性亮斑，western檢測(cè)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)水平也高于觀察對(duì)象組(P＜0.05)，而且Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組較之Ⅰ期矽肺組AMs胞漿中LC3陽(yáng)性亮斑增多，western檢測(cè)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)水平也同樣高于Ⅰ期矽肺組(P＜0.05)。
　　二、矽肺患者AMs中自噬體數(shù)量增多，溶酶體數(shù)量減

13、少
　　透射電子顯微鏡下觀察AMs中的自噬體數(shù)隨著矽肺期別的增加而增多，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組自噬體數(shù)高于觀察對(duì)象組，Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組高于Ⅰ期矽肺組，而溶酶體數(shù)隨著矽肺期別的增加而減少(P＜0.05)。
　　三、矽肺患者AMs自噬降解出現(xiàn)障礙
　　溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP2表達(dá)隨著矽肺期別的增加而減少(P＜0.05)。自噬降解的底物蛋白SQSTM1在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組的表達(dá)高于觀察對(duì)象組，Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組SOSTM

14、1表達(dá)高于Ⅰ期組(P＜0.05)，
　　四、矽肺患者AMs自噬的變化與mTOR非依賴和mTOR依賴調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)
　　自噬相關(guān)信號(hào)通路蛋白BECN1/Beclin1在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組的表達(dá)高于觀察對(duì)象組，Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組BECN1蛋白表達(dá)高于Ⅰ期組(P＜0.05)，而自噬相關(guān)信號(hào)通路蛋白p-mTOR的表達(dá)與之相反，p-mTOR在觀察對(duì)象組中的表達(dá)高于Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組，Ⅰ期矽肺組p-mTOR表達(dá)高于Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組(

15、P＜0.05)。
　　五、矽肺患者AMs中TLR4蛋白表達(dá)降低
　?、衿?、Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組AMs中的TLR4表達(dá)低于觀察對(duì)象組，Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組TLR4的表達(dá)低于Ⅰ期矽肺組(P＜0.05)。TLR4相關(guān)信號(hào)通路蛋白MYD88和TICAM1在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組的表達(dá)低于觀察對(duì)象組，Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組MYD88和TICAM1的表達(dá)低于Ⅰ期矽肺組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、矽肺患者AMs中溶酶體數(shù)量的減少