拮抗菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)合成銀納米粒子的初步研究及五株新菌的鑒定.pdf

1、銀納米粒子(silver nanoparticles，AgNPs)具有許多獨(dú)特的物理化學(xué)特性，使其在光學(xué)、電子、催化以及醫(yī)藥領(lǐng)域等有著非常廣泛的應(yīng)用。過(guò)去的數(shù)十年，許多制備技術(shù)已經(jīng)能夠控制合成的銀納米粒子的粒徑、形狀和表面形貌。與傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法相比，生物合成法利用細(xì)菌、真菌和植物等合成銀納米粒子，避免有毒化學(xué)試劑的使用，具有對(duì)環(huán)境無(wú)污染、成本低等優(yōu)點(diǎn)，吸引了眾多研究者的關(guān)注。本文以海洋沉積物樣品作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)傳統(tǒng)的富集方法結(jié)合點(diǎn)

2、種法分離拮抗菌，并篩選出一株拮抗菌，利用其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)合成銀納米粒子。利用紫外-可見(jiàn)分光光度法（UV-Visible spectrometry，UV-Vis）、掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscopy，SEM)和X射線(xiàn)衍射分析（X-ray diffraction，XRD）的方法對(duì)銀納米粒子進(jìn)行表征;以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為抑菌對(duì)象，對(duì)銀納米粒子的抑菌性能進(jìn)行檢測(cè)。
　　本實(shí)驗(yàn)以威海小石島自然

3、海域(37°31′2″N122°1′19″E)采集的底泥樣品作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)富集、稀釋涂布平板后，以大腸桿菌(Escherichia coli ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC29213)、鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii ATCC19606)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticusATCC17802T)四株病原菌作為指示菌株，以

4、點(diǎn)種法篩選出242株細(xì)菌，其中有177株細(xì)菌具有抑菌性。基于16S rDNA基因測(cè)序?qū)卓咕M(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)菌株屬于厚壁菌門(mén)。
　　從分離到的拮抗菌中，挑選出一株拮抗性強(qiáng)的細(xì)菌DXFD1，經(jīng)克隆測(cè)序得到其完整的16S rDNA序列(1474 bp)，經(jīng)比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)菌株DXFD1與枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillus subtilis subsp.subtilis NCIB3610T)的16S rDNA相似性最高(99.5

5、9％)。利用菌株DXFD1產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)溶液與AgNO3溶液混合，置于磁力攪拌器上合成銀納米粒子，并對(duì)合成的銀納米粒子進(jìn)行UV-Vis光譜、SEM和XRD表征。結(jié)果顯示:銀納米粒子多為球形或近球形，粒徑分布在30-70 nm，含銀納米粒子的混合液的UV-Vis光譜顯示在480 nm處有吸收峰。以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為檢測(cè)菌株，對(duì)銀納米粒子的抑菌性能進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明:銀納米粒子在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯的抑菌效果，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌

6、的最小抑菌濃度均為5μg/mL，最小殺菌濃度為10μg/mL。檢測(cè)去除表面附著物質(zhì)的銀納米粒子的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)抑菌效果降低，結(jié)果表明抑菌物質(zhì)在合成銀納米粒子的過(guò)程中結(jié)合到粒子表面，提高銀納米粒子的抑菌性能。
　　本文對(duì)從威海附近海域、文登鹽場(chǎng)、肥城精致鹽場(chǎng)樣品中分離到的編號(hào)為P131T、N62T、X7T、WDS2C4T與JZ3A21五株新菌進(jìn)行了多相分類(lèi)學(xué)鑒定。
　　菌株P(guān)131T分離自威海近海沉積物，為革蘭氏陰性菌、好氧、

7、無(wú)滑動(dòng)性、細(xì)胞呈桿狀。菌株P(guān)131T的最適生長(zhǎng)溫度為28-30℃，最適pH為7.0-7.5，可耐受的鹽度最為2.0-3.0％(w/v) NaCl?；?6S rDNA序列的分析表明，菌株P(guān)131T屬于比齊奧氏菌屬，與屬內(nèi)物種的16S rDNA相似性范圍為94.6-97.0％。菌株P(guān)131T主要脂肪酸組分為iso-C15∶0、 iso-C15∶oG、iso-C17∶03-OH和iso-C171ω9c。主要的極性脂成分包括磷脂酰乙醇胺、兩種

8、氨脂質(zhì)、氨磷脂、磷脂和其他的脂質(zhì)。主要呼吸醌類(lèi)型為MK-6?；蚪MDNA的G+C含量是36.7 mol％。根據(jù)遺傳學(xué)和表型特征證據(jù)，菌株P(guān)131T(=KCTC42587T=MCCC1H00124T)代表比齊奧氏菌屬的一個(gè)新物種，命名為沉積物比齊奧氏菌(Bizionia sediminis sp.nov.)。
　　菌株N62T分離自自威海近海沉積物，為革蘭氏陰性、兼性厭氧、無(wú)運(yùn)動(dòng)性和細(xì)胞短桿狀。2216E固體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)2天，形

9、成圓形、光滑、橘色和直徑約為0.6-1.5 mm的單菌落。菌株N62T最適生長(zhǎng)溫度為28-30℃，最適pH為7.0-7.5和最適鹽度2.0-3.0％(w/v) NaCl。菌株N62T主要的脂肪酸組分是iso-C15∶0、iso-C15∶0G、iso-C17∶03-OH和C17∶13-OH。主要的呼吸醌類(lèi)型是MK-6。菌株N62T基因組DNA的G+C含量是35.3 mol％。主要的極性脂是磷脂酰乙醇胺、兩種氨脂質(zhì)、糖脂和三種其他的脂質(zhì)?；?/p>

10、于16S rDNA序列的分析表明，菌株N62T屬于藏紅花黃色線(xiàn)菌科（Crocinitomicaceae），與寒冷微菌屬的物種的16S rDNA序列相似性范圍為95.8-97.2％。根據(jù)遺傳學(xué)和表型特征證據(jù)，菌株N62T(=KCTC42589T=MCCC1H00117T)，代表寒冷微菌屬的一個(gè)新物種，命名為橙色寒冷微菌（Brumimicrobium aurantiacum sp.nov.）。
　　菌株X7T分離自自威海近海沉積物，細(xì)

11、胞革蘭氏陰性、無(wú)滑動(dòng)性、兼性厭氧和短桿狀。最適生長(zhǎng)溫度為28-30℃，最適pH為7.0和最適鹽度2.0-3.0％（w/v）NaCl?；?6S rDNA序列的分析表明，菌株X7T屬于鹽坑微菌屬，與Salinimicrobium gaetbulicola有著最高的16S rDNA序列相似性(96.3％)。主要脂肪酸為anteiso-C15∶0、iso-C15∶0、 anteiso-C17∶1ω9c、iso-C17∶1ω9c、 C17∶02

12、-OH和iso-C17∶03-OH。主要極性脂是一種磷脂酰乙醇胺、一種磷脂、兩種氨脂質(zhì)和五種其他未確定的脂質(zhì)。主要呼吸醌類(lèi)型是MK-6?；蚪MDNA的G+C含量是46.7mol％。遺傳學(xué)、表型特征以及化學(xué)組分結(jié)果表明，菌株X7T(=KCTC42585T=MCCC1H00115T)代表鹽坑微菌屬的一個(gè)新物種，命名為黃色鹽坑微菌(Salinimicrobium flavum sp.nov.)。
　　菌株WDS2C4T和JZ3A21分別

13、從文登鹽場(chǎng)、肥城精致鹽場(chǎng)的樣品分離到，細(xì)胞為革蘭氏陰性、長(zhǎng)桿狀和無(wú)滑動(dòng)性。生長(zhǎng)范圍:可耐受鹽度1.0-20.0％(w/v)NaCl(最適6.0-10.0％)，溫度20-50℃（最適37-40℃）和pH6.5-9.5(最適7.0-8.0)。菌株WDS2C4T和菌株JZ3A21主要脂肪酸組分均是cyclo-C19∶0ω8c、summedfeatures8(C18∶1ω7cand/or C18∶1ω6c)、C18∶0、 C17∶0、C16∶0

14、和11-methyl C18∶1ω7c。菌株WDS2C4T和JZ3A21主要的呼吸醌類(lèi)型是Q-10。菌株WDS2C4T的基因組DNA的G+C含量為67.7 mol％，菌株JZ3A21的基因組DNA的G+C含量為67.3mol％。菌株WDS2C4T主要極性脂成分是兩種磷脂、氨脂質(zhì)、磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿和兩種糖脂。菌株WDS2C4T與Rhodovulum marinum JCM13300T的16SrDNA序列相似性最高為95.11％。與物

15、種Albidovulum xiamenense、Paracoccusaestuarii、Rhodobacter vinaykumarii和Roseiviv ax pacificus的模式菌株的相似性分別為94.75％、94.00％、93.88％和93.85％。根據(jù)16S rDNA序列建立的三個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(Neighbour-joining，maximum-likelihood和maximum-parsimony)表明，菌株WDS2C4T