利用REMI法建立尖孢鐮刀菌甜瓜?；偷倪z傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng).pdf

1、尖孢鐮刀菌是一種世界性分布的重要植物病原真菌，寄主范圍廣泛，可引起100多種植物的維管束萎蔫病害。構(gòu)建表達(dá)載體質(zhì)粒，進(jìn)行尖孢鐮刀菌的遺傳轉(zhuǎn)化，對所轉(zhuǎn)化的尖孢鐮刀菌進(jìn)行生物化學(xué)與分子生物學(xué)檢測，這對于了解尖孢鐮刀菌的致病機(jī)理具有重要意義，為進(jìn)行進(jìn)一步的生防研究奠定基礎(chǔ)。限制酶介導(dǎo)整合轉(zhuǎn)化(REMI)的方法由于其操作簡單，轉(zhuǎn)化效率高，單拷貝整合多，正被越來越多地應(yīng)用于絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化。 本研究較系統(tǒng)地對尖孢鐮刀菌的REMI轉(zhuǎn)化體系

2、進(jìn)行了摸索和優(yōu)化，并對部分轉(zhuǎn)化子的表型進(jìn)行了初步的分析，建立起了一套完整、有效的尖孢鐮刀菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，主要結(jié)果如下： 1、掌握尖孢鐮刀菌菌絲的培養(yǎng)條件，分生孢子的獲得及轉(zhuǎn)化前分生孢子的再培養(yǎng)。為了獲得幼嫩的菌絲，分生孢子進(jìn)行再培養(yǎng)時(shí)以50mL的PD培養(yǎng)基中加入107個(gè)左右的孢子為宜，培養(yǎng)溫度和搖床轉(zhuǎn)速分別為28℃和80r/min，培養(yǎng)時(shí)間為l0～12h。 2、尖孢鐮刀菌原生質(zhì)體的制備是整個(gè)轉(zhuǎn)化中最關(guān)鍵的一步，酶解得到的

3、原生質(zhì)體的數(shù)量和質(zhì)量直接影響到轉(zhuǎn)化的效果。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，把溶壁酶配置成2％的濃度，酶解尖孢鐮刀菌菌絲的細(xì)胞壁時(shí)以32℃的溫度，搖床輕輕晃動(dòng)3h左右可獲得大量的高質(zhì)量原生質(zhì)體。 3、分別提取原始尖孢鐮刀菌和轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，經(jīng)過18S rDNA基因序列測定，證明了轉(zhuǎn)化前后的菌株為尖孢鐮刀菌。設(shè)計(jì)特定的引物擴(kuò)增潮霉素基因片段，原始的尖孢鐮刀菌無潮霉素基因片段，而三個(gè)轉(zhuǎn)化子均擴(kuò)出了潮霉素基因片段。 4、轉(zhuǎn)化子表型分析發(fā)現(xiàn)，