甜瓜性別相關(guān)基因遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、本研究從建立高頻再生體系入手，以甜瓜子葉節(jié)為外植體，對(duì)其不定芽和植株再生進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，并對(duì)甜瓜不定芽再生過程中的生理生化和內(nèi)源激素動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究，初步分析和探討了甜瓜不定芽發(fā)育機(jī)理。建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)組培法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)莖尖不定芽法和花粉管通道法三種遺傳轉(zhuǎn)化方法，將性別相關(guān)基因?qū)氲骄哂兄匾茝V價(jià)值的甜瓜品系中。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、本試驗(yàn)以甜瓜子葉節(jié)為外植體，6-BA為主要誘導(dǎo)激素，輔之以IAA，建立了穩(wěn)定的甜瓜子

2、葉節(jié)再生體系。甜瓜子葉節(jié)在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上直接分化出了叢生芽，對(duì)于本研究所用的4份試材，最終獲得4號(hào)品系最適激素水平為6-BA的有效濃度1mg/L，IAA的有效濃度0.01mg/L，再生頻率為96.7％。
　　 2、甜瓜子葉節(jié)外植體再生過程SOD、可溶性糖含量、POD、CAT、可溶性蛋白、葉綠素呈有規(guī)律的動(dòng)態(tài)變化。這些生理生化指標(biāo)的變化與不定芽的產(chǎn)生密切相關(guān)?？扇苄蕴?、可溶性蛋白含量在甜瓜不定芽產(chǎn)生過程中呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，可見，這

3、些物質(zhì)在不定芽發(fā)生過程中起著重要的作用。在3種抗氧化酶中，SOD活性變化在愈傷組織的早期發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用;CAT活性變化對(duì)不定芽的誘導(dǎo)發(fā)生、后期發(fā)育階段起主導(dǎo)作用;而POD活性變化在不定芽發(fā)生過程中作用不明顯，并且SOD與CAT活性變化有一定相關(guān)性。兩種抗氧化酶在愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化、發(fā)育和成熟過程中分工合作、相互配合。4個(gè)甜瓜品系的葉綠素（葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、葉綠素總量）含量均呈現(xiàn)大幅下降趨勢(shì)，即在無菌苗時(shí)期，葉綠

4、素的含量為最高值。表明無菌苗時(shí)期光合作用能力最強(qiáng)，而在愈傷組織生長(zhǎng)過程中，光合能力減弱。較高的ZR含量有利于不定芽的誘導(dǎo)，較低的IAA/ZR比值和較高的ZR/ABA比值有利于甜瓜子葉節(jié)的再生。
　　 3、在建立了高頻再生體系的基礎(chǔ)上，對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)下子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化過程中，Km使用濃度等主要影響因素進(jìn)行了系統(tǒng)研究，優(yōu)化了轉(zhuǎn)化流程，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)甜瓜子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化體系，對(duì)獲得的抗性植株進(jìn)行了PCR和Southern雜交檢測(cè)，陽性轉(zhuǎn)化

5、率為2.25％。
　　 4、通過對(duì)主要影響因素進(jìn)行系統(tǒng)研究，確立了甜瓜授粉授精時(shí)間，優(yōu)化了花粉管通道法遺傳轉(zhuǎn)化體系。建立了T1代抗性種子的篩選體系，對(duì)獲得的抗性植株進(jìn)行了PCR檢測(cè)，陽性率為0.05％。
　　 5、對(duì)莖尖產(chǎn)生不定芽的激素水平等主要影響因素進(jìn)行了研究，建立了莖尖遺傳轉(zhuǎn)化體系，優(yōu)化了轉(zhuǎn)化流程中的各項(xiàng)參數(shù)。對(duì)獲得的抗性植株進(jìn)行了PCR和Southern雜交檢測(cè)，陽性率為8％。
　　 6、通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，

6、選擇不同性別甜瓜植株差異表達(dá)的EST，獲得同源片段后，從甜瓜雌雄異花同株中克隆獲得一條具有完整閱讀框的CmACS-3基因序列，與公布的哈密瓜CmACS-3序列二者核苷酸序列相同率達(dá)98％。CmACS-3全長(zhǎng)1865bp，該序列編碼區(qū)長(zhǎng)度為1446bp，編碼481個(gè)氨基酸。該基因在甜瓜幼苗根、莖、葉中均表達(dá)。通過構(gòu)建植物表達(dá)載體，莖尖法轉(zhuǎn)化甜瓜品系M-23，轉(zhuǎn)基因植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)正常，雌蕊正常，花藥上花粉量少，通過花粉離體萌發(fā)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)花粉萌發(fā)