家蠶核型多角體病毒廣東分離株空斑克隆株系的建立及其bro基因家族的分析.pdf

1、通過比較NCBI數據庫中BmNPVT3株和SC7株的序列得知，不同地區(qū)的BmNPV基因組序列存在一定差異，并且大的差異主要位于bro(baculovirusrepeatedopenreadingframes)基因家族所在的區(qū)域。bro家族是一類在昆蟲桿狀病毒科中出現的多基因家族，在不同的病毒株中有不同的拷貝，且在堿基序列上也有明顯不同。近年來，有關BmNPVbro基因的研究較多，學者們認為bro基因在病毒侵染宿主的過程中具有一定的功能。

2、BmNPVT3株基因組中存在bro-a,bro-b,bro-c,bro-d,bro-e5個拷貝，它們分布于基因組的三個區(qū)域。我們研究發(fā)現，BmNPVCQ1株在基因組的第二個區(qū)域缺失bro-b基因，GD株在基因組的第三個區(qū)域缺失bro-e基因。本研究以BmNPVGD株為研究材料，對其進行了空斑純化，并對其bro基因家族進行了克隆分析，對bro基因的功能和進化進行了探討。 1.BmNPVGD分離株空斑克隆株系的建立及驗證以家蠶胚胎細

3、胞系(BmE-SWU1)為病毒培養(yǎng)載體，利用中性紅染色的方法對BmNPVGD株進行了空斑克隆，經擴大培養(yǎng)，獲得GD株空斑克隆株系。根據BmNPVCQ1株基因組序列的單核苷酸多態(tài)性分析，選出其中SNP位點較多的gcn2(GeneralControlNonderepressible2)基因，用于驗證BmNPVGD株空斑克隆株系的純粹性。分別從BmNPVGD株和空斑克隆株的基因組中擴增gcn2基因，經T-克隆后測序；將兩株病毒的gcn2基因分

4、別進行單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點分析，發(fā)現GD株gcn2基因的潛在SNP位點有2個，而空斑克隆后的病毒株5條gcn2基因序列比較后則未發(fā)現多態(tài)性位點，說明空斑克隆株經純化后，病原基因組的純粹性得到提高，病原得到了純化。 2.bro基因的同源性分析分析bro基因在各病毒株基因組中的分布情況，bro基因主要分布在基因組的三個區(qū)域，以T3基因組的bro分布為標準，CQ1株在第二個區(qū)域缺失bro-b基因，GD株在第三個區(qū)域缺失bro-

5、e基因，而bro-d基因在幾株病毒中都存在。以BmNPVGD株空斑克隆株的基因組為模板，擴增出bro-a，RegionⅡ(主要包括bro-b和bro-c基因)，bro-d三個片段。與GenBank數據庫中BmNPVbro基因序列及本實驗室測定的CQ1株的bro基因序列進行比較分析，結果表明BmNPVGD株bro基因存在插入及缺失，bro基因同源性較高，差異主要集中在其氨基酸序列的N端部分。經ANTHEPRO5.0軟件預測GD株BRO蛋白

6、均無跨膜區(qū)和信號肽。 3.bro基因的系統(tǒng)發(fā)育分析與功能分析采用鄰接法進行的bro基因的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，GD株bro基因分別位于3個亞組中，GD株bro-d與日本T3株、重慶CQ1株bro-d以及法國SC7株bro-Ⅲ屬于亞組A；其bro-a,c與T3株、CQ1株bro-a,c以及SC7株bro-Ⅱ屬于亞組B；其bro-b與T3株、CQ1株bro-b,e以及SC7株bro-Ⅰ屬于亞組C，C亞組的bro基因與A亞組和B亞組的br

7、o基因具有較大的進化分歧，bro基因進化與地理位置的相關性不明顯。根據bro基因在四個不同株系基因組中的位置特征，進一步支持了Kang等的觀點：bro-d是BmNPV生存所必需的，bro-a和bro-c相互間功能互補。同時推測bro-b和bro-e功能可能是互補或相同，SC7株的3個bro基因可能是BmNPVbro家族出現的最簡約形式。另外，GD株BRO蛋白N端序列符合前人發(fā)現的保守序列模式，但也發(fā)現其C端也是高度保守的。在GD株和CQ