東亞飛蝗氣味分子結(jié)合蛋白異形體的多態(tài)性及發(fā)育特征.pdf

1、為了研究東亞飛蝗 Locusta migratoria manilensis氣味分子結(jié)合蛋白(odorant-binding proteins， OBPs)以及化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins，CSPs)的功能，我們利用電子顯微鏡技術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)相結(jié)合的方法首次系統(tǒng)地研究了胚胎觸角中化學(xué)感器的發(fā)育以及OBP和CSP蛋白的發(fā)生；利用雙向電泳和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)首次研究了蝗蟲不同生理階段兩種蛋白的多態(tài)性發(fā)育特點(diǎn)；采

2、用生物化學(xué)、分子生物學(xué)和質(zhì)譜分析技術(shù)探討了東亞飛蝗觸角中OBP蛋白的多態(tài)性表達(dá)情況。主要結(jié)果如下： Ⅰ．OBPs的發(fā)育特征采用細(xì)胞免疫組織化學(xué)技術(shù)首次明確了OBP的發(fā)生時間，即在胚胎孵化前半小時特異地表達(dá)在錐形感器和毛形感器中。 采用細(xì)胞免疫組織化學(xué)技術(shù)和電子顯微鏡技術(shù)首次較為系統(tǒng)地研究了飛蝗錐形和毛形感器的發(fā)育特征及其與OBP發(fā)生的相關(guān)性。一個鞘細(xì)胞和五個毛原細(xì)胞，在第二次胚胎蛻皮過程中形成伸出表皮的毛狀結(jié)構(gòu)。兩個膜原

3、細(xì)胞分泌形成感器的毛窩。伸出的樹突外節(jié)退化，毛原細(xì)胞內(nèi)的樹突外節(jié)產(chǎn)生分支后，開始分泌氣味分子結(jié)合蛋白。另外對刺形感器和腔錐形感器的發(fā)育特征也進(jìn)行了研究。 采用雙向電泳和免疫印跡技術(shù)首次研究了OBP在飛蝗觸角中的表達(dá)多態(tài)性特點(diǎn)。在胚胎期6天、9天和12天的觸角總蛋白中，沒有探測出飛蝗OBP。對于四齡蝗蝻雌雄蟲，都有兩個蛋白質(zhì)與抗血清發(fā)生反應(yīng)，分子量分別為15.0237 kDa，15.0517 kDa，等電點(diǎn)均為4.72，編號為a，

4、b。對于雌成蟲，交配前有四個點(diǎn)反應(yīng)，除了a，b蛋白點(diǎn)外，還有編號為c，d的蛋白，分子量為15.0237 kDa，15.0116 kDa，等電點(diǎn)為4.68，4.75，而交配前的雄成蟲除了有以上相同的四個點(diǎn)外，還有相近的第五個點(diǎn)(編號為e)(分子量和等電點(diǎn)為15.0384 kDa，4.7)與抗血清發(fā)生交叉反應(yīng)。在雌成蟲產(chǎn)卵后及雄成蟲交配后，OBP的表達(dá)方式明顯不同于其他的發(fā)育階段，雌雄成蟲均有三個(編號為a，b，c)與其他發(fā)育階段相同的蛋白

5、質(zhì)表達(dá)，但二者還都有一個具有較高分子量(約30kDa)和較低等電點(diǎn)(約pH4.2)的蛋白質(zhì)存在，編號為f。OBP在不同發(fā)育時期的發(fā)育多態(tài)性說明OBP可能與蝗蟲感知不同發(fā)育階段的信息化合物有關(guān)。 Ⅱ．氣味分子結(jié)合蛋白的多態(tài)性表達(dá)本文根據(jù)雙向電泳及免疫印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果采用分子生物學(xué)技術(shù)新明確了飛蝗OBP的2個異形體(isoforms)。采用5’RACE技術(shù)首次鑒定得到了飛蝗OBP信號肽。對其中的一個isoform進(jìn)行原核表達(dá)后進(jìn)行結(jié)合

6、實(shí)驗(yàn)，沒有發(fā)現(xiàn)任何可能的結(jié)合配基存在。 采用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)對新鑒定的OBP序列進(jìn)行了三維結(jié)構(gòu)模擬，并且模擬了不同pH值條件下的α螺旋含量的變化特點(diǎn)。 Ⅲ．觸角部分蛋白的化學(xué)分析采用雙向電泳和飛行時間質(zhì)譜技術(shù)分析了飛蝗觸角總蛋白中的分子量在12kDa～20kDa．，pH值在4～6之間20個蛋白，其中有一蛋白點(diǎn)經(jīng)酶解后的肽片段與黑腹果蠅OBP56c部分片段相匹配，同源性為24％。說明飛蝗觸角中可能存在其他同源性較低的OBP。

7、 Ⅳ．CSPs的發(fā)育特點(diǎn)本文首次明確了CSP的發(fā)生以及在蝗蟲羽化前后表達(dá)量的差異變化。CSPⅡ同樣地在胚胎即將孵化前半小時開始表達(dá)，但特異地表達(dá)在刺形感器中。另外，CSPⅠ和CSPⅡ在蝗蝻和成蟲期均表達(dá)，CSPⅢ只在蝗蝻期表達(dá)；觸角中CSPⅠ和CSPⅡ蛋白在羽化前表達(dá)量達(dá)到最高值，羽化后兩種蛋白質(zhì)表達(dá)量很少，直到羽化后第五天的表達(dá)量基本和羽化前第五天的表達(dá)量相同。但是LmigOBP在蝗蟲羽化前后表達(dá)量基本沒有變化，表明LmigC