產果膠酶黑曲霉的紫外誘變及其合成調節(jié)機制的蛋白質組學研究.pdf

1、果膠酶是一種重要的工業(yè)用酶,廣泛應用于果汁處理,紡織,造紙和飼料等工業(yè)。本文以一株果膠酶產生菌Aspergillus niger EIM-6為出發(fā)材料,通過反復紫外誘變處理,最終獲得一株果膠酶高產菌株EIMU2。相較于野生型EIM-6,突變菌株EIMU2的形態(tài)和生長特征發(fā)生了明顯的改變,主要表現(xiàn)為孢子色澤更黑,孢子團大,菌絲與孢子上凝結有更多的液珠；同時,菌絲更為粗壯,生長更快。經復篩后EIMU2酶活可達32161U/mL,較原出發(fā)菌株

2、的初始酶活14539 U/mL提高了1.212倍。進一步通過響應面法對EIMU2菌株的液體發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為甜菜渣1.83％,花生餅粉1.69％,(NH4)2SO40.5％,K2HPO40.3％,CaCO30.2％,MgSO40.15％(w/v),接種量6％(v/v),裝液量21.36 mL。優(yōu)化后的突變菌株產酶活性進一步提高至98794.3 U/mL,提高了2.07倍。
　　 為了解釋黑曲霉突變后果膠酶高

3、產的產生機制,本實驗進一步從酶蛋白表達總量的提高,酶基因自身的突變和多酶復合體系酶組分及其比例的變化這三個方面進行研究。在相同條件下接種培養(yǎng)野生株EIM-6與突變株EIMU2,發(fā)酵結束后分別提取它們胞外總蛋白,稱重。對比發(fā)現(xiàn)突變株EIMU2的胞外總蛋白量較野生株EIM-6提高了14-17％。結果說明黑曲霉胞外酶蛋白表達總量的提高果膠酶高產的一個因為之一。對突變菌株EIMU2的胞外總蛋白進行蛋白雙向電泳,鑒別該黑曲霉果膠酶復合體系的酶組分

4、構成。通過2-DE凝膠蛋白斑點的質譜鑒定和數(shù)據檢索,最終得到5個與果膠酶降解相關的蛋白點。這5個點包含了除原果膠酶以外的其它所有果膠酶組分:聚半乳糖醛酸酶X2、果膠酯酶和果膠裂解酶A,其中果膠裂解酶存在三個異構體。質譜分析結果中得到的果膠酶組分的等電點均處于pI4.0-6.0之間,這也與之前酸性果膠酶的結論相符合。分別從野生型EIM-6和突變菌株EIMU2中克隆果膠酶主要成分--果膠裂解酶和聚半乳糖醛酸酶的基因、測序分析,比對,發(fā)現(xiàn)二者

5、的果膠裂解酶與聚半乳糖醛酸酶的基因完全一致,結果表明突變菌株果膠酶活性的提高不是來源于單一酶自身的基因突變。
　　 進一步對提取的兩株菌的胞外總蛋白(定量后取相同的蛋白量)進行差異蛋白質組學分析。從雙向電泳圖譜上可以看到4個有明顯差別的蛋白點,突變株EIMU2的這4個蛋白點含量明顯高于EIM-6,其余的蛋白質點具有明顯的對應關系,表達量沒有明顯差異。挖取四個差異點進行質譜分析。質譜分析結果顯示1號點為果膠酯酶,2號點為actib