脂肪源性干細胞在乳腺整形中的基礎研究.pdf

1、近年來，隨著干細胞研究的深入，成體干細胞逐漸顯示出越來越多的優(yōu)勢，它具有來源豐富，可塑性強，離成熟細胞較近，具有多向分化潛能等特點。最大特色是可以實現(xiàn)個體化治療，無免疫排斥問題，因而將優(yōu)先進入臨床使用。它可以從接受治療者體內直接分離，進行體外大量增殖，并誘導分化為所需要的細胞種類，然后再將它們移植回接受治療者體內，這樣就不會因發(fā)生免疫排斥反應而失敗，同時還可以避免因使用胚胎干細胞所帶來的倫理上的爭端和成瘤性的危險。 脂肪源性干

2、細胞是一種成體干細胞。經(jīng)研究證實它具有易于分離，易于培養(yǎng)，傳代多次而沒有明顯衰減的生物學特性，并有多向分化潛能，能在體外培養(yǎng)情況下，經(jīng)添加特異性誘導培養(yǎng)基定向分化培養(yǎng)成為成骨細胞，軟骨細胞，心肌細胞，平滑肌細胞和脂肪細胞，并能跨胚層分化為上皮細胞，肝樣細胞和神經(jīng)元樣細胞，從而顯示了它作為一種細胞治療的良好載體和組織工程中種子細胞的廣闊的臨床應用價值。 目前所進行的有關脂肪源性干細胞的研究主要集中在它具有的一些生物學特性上，主要

3、是一些細胞的體外實驗，沒有細胞在活體動物體內的實驗觀察。本研究為了能進一步開發(fā)它在組織工程中的應用價值，特別是乳腺整形中的作用，希望它作為脂肪組織工程的種子細胞能盡早進入臨床應用，做了脂肪源性干細胞的脂肪定向誘導分化及動物體外體內實驗，因為臨床脂肪顆粒注射治療存在高吸收率問題，而且一次獲得的細胞數(shù)量有限，需要多次注射，故本研究也模擬臨床情況進行細胞多次注入。 研究目的： 從脂肪組織中分離，培養(yǎng)，鑒定脂肪源性干細胞并誘

4、導成為為脂肪細胞，將經(jīng)過BrdU標記并誘導后的細胞多次注入NOD-SCID小鼠體內，觀察細胞在活體動物體內的生長情況和對動物的影響。 研究方法： 1．無菌技術取SD大鼠雙側腹股溝脂肪墊，用I型膠原酶消化，獲取脂肪源性干細胞，接種于含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，觀測其生長情況，繪制生長曲線，鑒定其表面分子標志CD29,CD44,CD45。 2．添加脂肪定向誘導劑，將脂肪源性干細胞誘導成為脂肪細胞，并

5、用油紅O染色鑒定。 3．將經(jīng)過BrdU標記并誘導后的脂肪細胞連續(xù)三次，每次間隔十天，接種于NOD-SCID小鼠一側皮下，對側空白對照，觀察小鼠生長情況并在注射細胞結束后一個月和兩個月取材，觀察組織細胞形態(tài)學變化并用油紅O染色鑒定，BrdU免疫組化鑒定。 研究結果： 1．脂肪源性干細胞易于分離，培養(yǎng)，具有穩(wěn)定的擴增能力，可傳代十次，不易衰減。細胞表面分子標志鑒定結果：CD29,CD44分別為95％，98％，C

6、D45為6％。 2．通過添加脂肪定向分化誘導劑，于培養(yǎng)第四天前后細胞出現(xiàn)脂滴，十天后脂肪細胞生成率60％以上，細胞形態(tài)學和油紅O染色證實為脂肪細胞定向分化。繼續(xù)培養(yǎng)可見細胞變圓從培養(yǎng)瓶底壁游離。 3．將BrdU標記過并誘導而生成的成熟脂肪細胞接種入NOD-SCID小鼠一側背部皮下，對側空白對照。觀察到小鼠生長良好，注射細胞側可見局部隆起，隆起直徑約1cm，厚約2mm。對側陰性。經(jīng)組織切片發(fā)現(xiàn)存活于小鼠體內的細胞形態(tài)正

7、常，沒有異型性，經(jīng)油紅O染色證實為成熟脂肪組織。本實驗分別觀察了細胞注入NOD-SCID小鼠皮下一個月和兩個月后的情況，發(fā)現(xiàn)兩個月小鼠的移植脂肪細胞較一個月小鼠的移植脂肪細胞直徑增大，表明經(jīng)誘導后的細胞具有良好的生長能力，能適應從體外到體內的生存環(huán)境，并隨著環(huán)境的變化而變化，這一點體現(xiàn)在它能隨著小鼠的生長發(fā)育而積聚脂肪，成為成熟脂肪組織。而且因為本實驗中細胞為多次注入，也為臨床中分離培養(yǎng)細胞后多次治療提供了一定的參考價值，同時也發(fā)現(xiàn)成活

8、的脂肪組織中并沒有明顯的血管的生成，這說明成活的細胞可能主要是靠局部滲出的組織間液存活，同時因為局部脂肪的厚度僅為2mm左右，這也間接說明血管化的障礙可能也是影響細胞生長的重要因素。 結論： 1．脂肪源性干細胞易于提取，易于培養(yǎng)，不需額外添加很多營養(yǎng)物質就可生長良好。 2．脂肪源性干細胞體外培養(yǎng)增殖旺盛，經(jīng)十次傳代無明顯衰減。 3．脂肪源性干細胞經(jīng)CD29,CD44單克隆抗體表面標記陽性率高。CD