利用滾環(huán)放大技術(shù)及共振光散射檢測(cè)DNA及其突變的研究.pdf

1、滾環(huán)放大(rolling circle amplificatio，RCA)是新近發(fā)展起來(lái)的一種恒溫核酸擴(kuò)增方法。該技術(shù)是借鑒噬菌體DNA分子滾環(huán)式的復(fù)制方式建立起的核酸擴(kuò)增技術(shù)。這種方法可以直接擴(kuò)增DNA，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸的信號(hào)放大，取得核酸分析的高靈敏度，因此在核酸檢測(cè)中具有很大的應(yīng)用價(jià)值和潛力。
　　 在本文中，我們利用鎖式探針在連接反應(yīng)中的單堿基識(shí)別的特異性和滾環(huán)放大技術(shù)對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)研究了由于單堿基突變所形成的單

2、核苷酸多態(tài)性。鎖式探針是一段線性DNA，它可以與另一段具有特殊序列的DNA發(fā)生識(shí)別作用，彎曲成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。只有能夠發(fā)生連接反應(yīng)的鎖式探針才可發(fā)生滾環(huán)放大反應(yīng)。放大后，延伸產(chǎn)物與標(biāo)記在金納米粒子上的DNA進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)其共振光散射(resonancelight—scattering，RLS)強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)目標(biāo)DNA的含量。該方法在放大反應(yīng)后不需分離，得到的共振光散射強(qiáng)度與目標(biāo)DNA濃度在0．1 nmol/L～2.0 nmol/L范圍內(nèi)呈良好

3、線性關(guān)系，檢出限為0.077 nmol/L。
　　 在RCA反應(yīng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的堿基延伸，當(dāng)dNTPs結(jié)合到模板的同時(shí)釋放出等量的焦磷酸(PPi)，而焦磷酸可以降解為磷酸，所以可以通過(guò)檢測(cè)溶液中磷酸的含量間接檢測(cè)DNA。本文第三部分中，我們建立了一種測(cè)定微量磷酸的共振光散射分析新方法。研究發(fā)現(xiàn)在H2SO4介質(zhì)中，PO43—與MoO42—反應(yīng)生成磷鉬雜多酸，磷鉬雜多酸與陽(yáng)離子染料奎寧可形成穩(wěn)定的離子締合物，并在398.0 nm處