共振光散射技術(shù)在蛋白質(zhì)分析中的研究及其應(yīng)用.pdf

1、共振光散射技術(shù)在蛋白質(zhì)分析中的研究及其應(yīng)用第一章緒論1.1引言1.1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基本信息及其檢測方法1.2.1蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)近代分子生物學(xué)及生物化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)是由20種左右的α氨基酸通過肽鍵連接而成的多肽鏈，再由一個(gè)或一個(gè)以上的肽鏈按各自特殊的方式組合成蛋白質(zhì)分子，水解后產(chǎn)生α氨基酸。隨著氨基酸排列次序、分子數(shù)目以及肽鏈數(shù)目和其空間結(jié)構(gòu)的不同而形成不同的蛋白質(zhì)[17]。為了從分子水平上了解蛋白質(zhì)的作用機(jī)制，常常需要測定蛋白質(zhì)的三維結(jié)

2、構(gòu)。由研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)而發(fā)展起來了結(jié)構(gòu)生物學(xué)，采用了包括X射線晶體學(xué)、核磁共振等技術(shù)來解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。長期以來對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可分為一級、二級、三級和四級結(jié)構(gòu)[18]。1.2.1.1蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的二級、三級等高級結(jié)構(gòu)是由蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)決定的，蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)決定著每一種蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。成千上萬的天然蛋白質(zhì)有其各自特殊的生物學(xué)活性，蛋白質(zhì)生物活性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)在于它肽鏈的氨基酸序列，以及組成蛋白質(zhì)的20

3、種氨基酸各具有的特殊側(cè)鏈[20]，側(cè)鏈的基團(tuán)理化性質(zhì)和空間排布各有不同，當(dāng)側(cè)鏈的基團(tuán)按照不同的序列關(guān)系組合時(shí)，就可形成形態(tài)各異的空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性不同的蛋白質(zhì)分子。1.2.1.2蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)多肽鏈本身折疊和盤繞方式就是蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)[21]。α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角是蛋白質(zhì)主要的二級結(jié)構(gòu)。其中α螺旋和β折疊是蛋白質(zhì)常見的二級結(jié)構(gòu)。二級結(jié)構(gòu)是通過骨架上的羰基和酰胺基團(tuán)之間形成的氫鍵維持的，氫鍵是穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的主要作用力[22]

4、。ββ折折疊疊((ββpplleeaatteeddsshheeeett))αα螺螺旋旋((ααhheelliixx))共振光散射技術(shù)在蛋白質(zhì)分析中的研究及其應(yīng)用熒光法測定蛋白質(zhì)的最大優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，缺點(diǎn)是它僅適用于熒光體系，導(dǎo)致它的使用范圍受到限制。1.2.2.3共振光散射法近年來，共振光散射法[38]作為高靈敏的分析測試技術(shù)在臨床分析、生化分析、痕量金屬的測定中得到了研究和應(yīng)用。共振光散射的分析應(yīng)用主要集中于兩方面：（1）.利用生色團(tuán)

5、在生物大分子上的聚集作用導(dǎo)致共振光散射強(qiáng)度的增強(qiáng)，對到蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子進(jìn)行定量測定。（2）.利用某些離子締合物會產(chǎn)生強(qiáng)烈的共振光散射強(qiáng)度，對痕量金屬、非金屬以及某些有機(jī)物進(jìn)行定量測定。共振光散射法測定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點(diǎn)有靈敏度高、選擇性好、線性范圍寬等。1.2本論文的研究內(nèi)容和目的生物化學(xué)和其它生物學(xué)科中經(jīng)常涉及的分析內(nèi)容之一就是蛋白質(zhì)的定量[103]測定，蛋白質(zhì)的定量測定也是臨床檢驗(yàn)中診斷疾病和檢查治療效果的重要指標(biāo)，也是許多生

6、化藥物分離提純中質(zhì)量檢驗(yàn)和食品檢驗(yàn)中常見的分析項(xiàng)目。近年來共振光散射法測定蛋白質(zhì)的含量越來越受到人們的關(guān)注，本論文進(jìn)行了以下工作：1.將Cu2與不同顯色劑作用生成的絡(luò)合物作為新的熒光探針，建立了若干測定蛋白質(zhì)含量的共振光散射新方法。本論文研究了藻紅Cu(Ⅱ)配合物與牛血清白蛋白(BSA)相互作用的共振光散射光譜(RLS)和電子吸收光譜的特征，建立了利用金屬配合物作為探針測定痕量蛋白質(zhì)的分析方法。藻紅與Cu(Ⅱ)形成的配合物導(dǎo)致RLS強(qiáng)度

7、增大，同時(shí)引起電子吸收光譜強(qiáng)度減小。在pH=3.78的酸度條件下，藻紅Cu(Ⅱ)配合物與牛血清白蛋白(BSA)體系在338nm處有一增強(qiáng)的RLS光譜峰。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，RLS強(qiáng)度與BSA濃度的線性范圍為0.5～10gmL，線性方程為IRLS=1.7146c16.327(BSAgmL)，相關(guān)系數(shù)r=0.9981，方法檢出限為0.16gmL。該方法可成功應(yīng)用于人工混合樣品中BSA的測定。對藻紅Cu(Ⅱ)配合物與牛血清白蛋白(BSA)相互