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文檔簡介
1、原腸發(fā)生運動是構建胚胎形體模式的關鍵事件,其運動模式和調控機制是生命科學探索了近百年的重大基礎科學問題。Paraxial protocadherin(papc)是一個細胞粘連分子,為跨膜蛋白,近來研究報道papc與Wnt/PCP途徑有關,控制著原腸形態(tài)發(fā)生過程中的集中延伸運動。一方面它的胞外結構能與細胞粘連,另一方面它能將接收到的信號轉換為實際的細胞運動。papc在斑馬魚胚胎下包50%時,在胚環(huán)的側面和腹面中胚層區(qū)域表達。近來研究發(fā)現同
2、源異型基因flh在原腸期斑馬魚胚胎的脊索中胚層中表達而直接抑制spt在該處的轉錄;而spt在軸旁中胚層表達并激活papc在軸旁中胚層的表達。因此flh和spt共同調控papc表達的空間模式而在原腸形態(tài)運動過程中起著重要的調控作用。我們的前期研究發(fā)現抑制斑馬魚中另一個同源異型基因vsxl基因的表達會導致原腸形態(tài)發(fā)生運動受阻和flh在側、腹中胚層區(qū)域的異位表達,以及spt和papc在這些中胚層區(qū)域的表達被抑制;而vsxl過表達時,flh基因
3、在脊索中胚層中的表達受到抑制。這些觀察結果提示vsxl能夠抑制flh基因在胚胎發(fā)育早期的異位表達。為進一步探究vsxl在原腸形態(tài)發(fā)生運動中的調控作用,本實驗進行了vsxl調控flh表達機制的深入分析。主要的結果和結論如下:
一、通過用vsxl mRNA分別與不同長度flh啟動子序列所控制的GFP報告基因共注射,檢測其對GFP報告基因表達的影響,證明了vsxl能有效抑制flh啟動子所控制的報告基因的表達,并確定了在flh啟動
4、子上的-204bp與-156bp之間可能含有vsxl或者vsxl下游基因作用的關鍵位點。
二、根據含有同源異型域的蛋白與DNA結合的潛在結合位點為TAAT(NN),對fth啟動子上的-204bp與-156bp之間的49bp的序列進行分析,發(fā)現有1個TAATTG位點。將TAATTG位點突變成TCGATG后構建了突變的報告基因MPZF-220GFP,再與vsxl mRNA共注射,則所控制的報告基因的表達不再受到抑制。這一結果說
5、明vsxl可能通過結合到flh基因啟動子的TAATTG序列上直接抑制flh的轉錄,而不是通過vsxl下游基因編碼的蛋白來間接抑制flh的轉錄。
三、為了進一步證明flh啟動子上的TAATTG序列是VSX1直接作用的位點,我們用pGEX原核表達系統(tǒng)在大腸桿菌中表達了包含VSX1同源異型域的重組蛋白GST+VSX1 HD,和在所確定的49bp的flh啟動子范圍內,針對TAATTG位點,設計并合成了生物素標記的包含該位點的探針,
6、不標記生物素的探針和將TAATTG位點突變?yōu)門CCCCG的突變探針;采用凝膠阻滯方法檢測了VSX1蛋白在體外與flh啟動子TAATTG序列的結合。凝膠阻滯分析結果為:結合探針和GST+VSX1 HD多肽反應后,在非變性凝膠中看到了在自由探針條帶之后的滯后條帶;而在預先加入的500倍于標記探針的非標記探針進行競爭時,則檢測不到標記的滯后條帶,而預先加入500倍于標記探針的非標記突變探針進行競爭時,仍可以檢測到滯后條帶。這些體外實驗的結果證
7、明VSX1的確能與flh啟動子上的TAATTG序列直接結合。
四、為了檢測在正常發(fā)育的胚胎細胞中VSX1是否與flh的啟動子直接結合以及結合位點的數目和位置,我們制備了多克隆抗體,并以其進行了染色質免疫共沉淀(CHIP)分析。對flh啟動子在1.9kb范圍內13個包含TAATTN序列的位點的進行分析的結果表明,VSX1只與在-204bp與-156bp區(qū)域內包含TAATTG序列特異結合,與其他的位點沒有結合。體內ChIP分析
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