電穿孔調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-1受體阻滯劑基因抑制大鼠骨性關(guān)節(jié)炎.pdf

1、目的:
　　基因治療為骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)的治療提供了可能性，目前該療法開展臨床研究的瓶頸在于尋找一種安全有效的基因?qū)胪緩?，本?shí)驗(yàn)驗(yàn)證作為非病毒載體的電穿孔(Electroporation，EP)對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的治療效果，并與研究最為廣泛的腺相關(guān)病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)載體作比較。
　　方法:
　　選用8周齡健康級(jí)雄性SD大鼠，在不同電穿孔參數(shù)下，使用電穿

2、孔將熒光素酶(Luciferase)報(bào)告基因轉(zhuǎn)染到大鼠膝關(guān)節(jié)組織內(nèi)，采用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)測(cè)定熒光強(qiáng)度，該強(qiáng)度反映在不同電穿孔參數(shù)下Luciferase基因表達(dá)水平，通過比較熒光強(qiáng)度以明確較佳的電穿孔參數(shù)。通過切斷右膝前交叉韌帶及切除內(nèi)側(cè)半月板前腳的方法建立骨性關(guān)節(jié)炎模型，在造模術(shù)后1周，按上述所選的較佳參數(shù)值進(jìn)行下一步大鼠體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)。選擇白細(xì)胞介素-1受體阻滯劑(Interleukin-1receptor antagonist，IL

3、-1Ra)作為目的基因，抑制由白細(xì)胞介素-1引起的炎癥反應(yīng)。根據(jù)不同的治療方式將實(shí)驗(yàn)分為五組:單純骨性關(guān)節(jié)炎未治療組（OA組，n=24）;骨性關(guān)節(jié)炎單純目的基因質(zhì)粒治療組(NP組，n=24);骨性關(guān)節(jié)炎電穿孔目的基因治療組(EP組，n=24);骨性關(guān)節(jié)炎腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染目的基因治療組(AAV組，n=24);正常對(duì)照組(Normal，n=24)。治療后1周開始評(píng)價(jià)，每周取材1次，共計(jì)4次。取材前使用CatWalk進(jìn)行步態(tài)分析，了解由于炎癥引

4、起的患肢疼痛情況;處死大鼠抽取右膝關(guān)節(jié)液進(jìn)行ELISA檢測(cè)，分析關(guān)節(jié)液中IL-1Ra、IL-1β、TNF-α蛋白含量變化;分離右膝關(guān)節(jié)股骨遠(yuǎn)端，進(jìn)行大體觀觀察，部分標(biāo)本立即進(jìn)行PCR檢測(cè)，了解IL-1Ra、IL-1β、TNF-α、MMP-13、ADAMTS-4基因的表達(dá)情況，部分標(biāo)本進(jìn)行Micro-CT掃描以了解軟骨下骨的重建情況，掃描后的樣本進(jìn)行固定脫鈣、石蠟切片、病理染色，包括蘇木素-伊紅染色、番紅O染色、甲苯胺藍(lán)染色、IL-1Ra

5、及Ⅱ型膠原的免疫組織化學(xué)染色。
　　結(jié)果:
　　在電穿孔參數(shù)脈寬為30ms，質(zhì)粒量為50μg時(shí)，右側(cè)膝關(guān)節(jié)表達(dá)的熒光強(qiáng)度明顯高于其余各組(p＜0.05)。在EP組及AAV組，由炎癥反應(yīng)引起的疼痛水平明顯的低于OA組和NP組(p＜0.05)，于軟骨缺損部位選取興趣區(qū)，測(cè)得軟骨下骨骨礦化密度、骨小梁厚度升高明顯不及OA組和NP組(p＜0.05); PCR結(jié)果顯示:EP組及AAV組IL-1Ra基因表達(dá)上調(diào)明顯高于其余組(p＜0.0

6、5)，前兩周顯示，AAV組的IL-1Ra表達(dá)量明顯的高于EP組，后兩周結(jié)果相反。在OA組和NP組，IL-1β、TNF-α表達(dá)明顯上調(diào)。EP組及AAV組IL-1β、TNF-α表達(dá)高于正常對(duì)照但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。MMP-13和ADAMTS-4的變化趨勢(shì)類似于IL-1β和TNF-α。ELISA結(jié)果顯示出與PCR相同的變化趨勢(shì);病理結(jié)果顯示:4周時(shí)，EP組及AAV組未見明顯軟骨破壞及細(xì)胞外基質(zhì)丟失，表達(dá)IL-1Ra陽(yáng)性區(qū)域分布在軟骨