ChREBP和ACC1在肝細胞糖-脂代謝調(diào)控中的作用.pdf

1、在整個生物體能量平衡中肝臟代謝調(diào)控系統(tǒng)起著關鍵作用,因為肝臟是糖代謝(糖酵解和肝糖原合成)和甘油三脂合成(脂肪生成)的主要部位。脂肪生成會受到關鍵酶的調(diào)控,這些酶的活性依靠變構和共價修飾產(chǎn)生。大部分糖酵解和脂肪生成過程中的酶的合成會受到進食狀況的調(diào)控,其中葡萄糖是起到至關重要作用的營養(yǎng)物質(zhì)。葡萄糖主要作用于編碼這些酶的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。
　　 糖應答元件結合蛋白(ChREBP)和乙酰輔酶A羧化酶(ACCs)是糖/脂代謝過程中兩

2、個重要因子。ChREBP是堿性/環(huán).螺旋.環(huán)/亮氨酸拉鏈(bHLH/LZ)轉(zhuǎn)錄因子家族成員,在肝臟內(nèi)大量表達的。它在進食高碳水化合物食物后會高效表達,而在進食高脂類食物后其表達會受到抑制。它對很多脂酶有調(diào)控作用。同時,ChREBP的活性又會被胰島素、葡萄糖和抗糖尿病類藥物的調(diào)節(jié)。因此,研究ChREBP的作用機理有著重要的意義。
　　 ACCs家族目前發(fā)現(xiàn)的有兩個成員:ACC1和ACC2。ACC1主要是在肝臟和脂肪組織的細胞質(zhì)中表

3、達；ACC2主要是在心臟和肌肉組織的線粒體中表達。ACCs是ChREBP的靶基因之一,會受到食物、激素和其他一些生理因子的調(diào)控。
　　 本研究采用real-time PCR和細胞轉(zhuǎn)染等技術,對豬ChREBP基因的生物學特性,ChREBP的功能和轉(zhuǎn)錄水平的表達調(diào)控,ACC1轉(zhuǎn)錄水平的表達調(diào)控等進行了研究,獲得如下結果:
　　 1.通過同源分析比較,以小鼠和人的ChREBP基因序列為參照,運用RT-PCR方法,獲得了豬ChR

4、EBP基因；以豬的心、肝、脾、和肺等11個組織樣品作為研究材料,通過半定量RT-PCR分析獲得了ChREBP的組織表達譜；通過輻射雜種板分析進行了ChREBP的染色體定位,并與人的定位結果進行了比較。
　　 2.在無血清無糖培養(yǎng)條件下,對HepG2人肝癌細胞系進行葡萄糖和胰島素的時間和梯度刺激。采用real-time PCR方法,檢測了ChREBP、膽固醇應答元件結合蛋白(SREBP-lc)、ACC1和脂肪酸合成酶(FAS)mR

5、NA的表達量。結果表明,葡萄糖在單獨作用時也可引起ChREBP、SREBP-lc、ACC1和FAS表達量的升高。
　　 3.以RT-PCR的方式,克隆得到ChREBP和SREBP-lc的編碼序列,分別構建真核表達載體。通過轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染,研究ChREBP和SREBP-lc對靶基因(ACC1)的調(diào)控作用。結果表明,ChREBP和SREBP-lc并無協(xié)同作用,相反它們有可能對靶基因啟動子區(qū)的調(diào)控位點有競爭作用。
　　 4.在游

6、離脂肪酸的作用下,細胞中ChREBP和SREBP-lc mRNA的表達量下降,而ACCl的表達量卻在花生四稀酸存在的情況下大幅度升高。相關因子肝臟x蛋白受體(LXR)和過氧化酶增值體激活受體(PPARα)在花生四稀酸的作用下表達量無明顯變化,但cAMP應答元件結合蛋白1(CREB1)的表達量有所增高。這表明,花生四稀酸不是通過已知兩條糖/脂代謝途徑來誘導ACC1表達的。
　　 5.檢測花生四稀酸誘導或轉(zhuǎn)染CREB1后的細胞培養(yǎng)液

7、中的葡萄糖含量和細胞中甘油三酯的含量,同時通過real-time PCR,檢測了細胞中葡萄糖吸收和脂肪酸合成的標志性基因--葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2(GLUT2),葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)和FAS的表達量。綜合以上結果,表明花生四稀酸對ACC1的誘導會引起細胞中甘油三酯的沉積,但對葡萄糖的攝取沒有明顯影響。
　　 6.構建CREB1的真核表達載體及ACC1的啟動子熒光素酶載體,進行轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染。通過real-timePCR檢測