miR-27a-b調(diào)控Tmub1在肝細胞增殖中的作用研究.pdf

1、背景：
　　我國是世界上肝炎性肝癌最嚴重的地區(qū)之一，臨床上我們希望切除更多病變肝臟，但伴隨而來的致命性的肝功能衰竭問題尤為嚴重，這就成為了一項難題。雖然肝移植是一種有效的治療途徑，但供體的嚴重不足限制了肝移植的應用，而有效刺激自身肝再生便是解決這些問題的理想途徑。新近研究發(fā)現(xiàn)，跨膜泛素樣蛋白1(Tmub1)是一種能夠在肝再生過程中發(fā)揮重要負性調(diào)控作用的蛋白。既往課題組對于Tmub1的研究多集中于下游，而對于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控階段并沒有太多

2、涉及。探討Tmub1蛋白與其上級調(diào)控因子之間的作用，能夠幫助我們更深一層的去解釋肝再生的相關機制。miRNA作為一種重要的在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平對目的蛋白進行上游調(diào)控的因子，在現(xiàn)階段越來越受到重視。我們通過生物信息學發(fā)現(xiàn)，在Tmub1 mRNA的3'非編碼區(qū)序列中存在miR-27a/b潛在的結合位點，所以，我們推測miR-27a/b能夠與Tmub1 mRNA結合并影響Tmub1蛋白表達水平，進而在肝再生過程中發(fā)揮調(diào)控肝細胞增殖的作用。研究肝再

3、生過程中miR-27a/b與Tmub1表達的關系，能夠為進一步闡明肝再生分子調(diào)控網(wǎng)絡提供新的參考資料，對臨床上治療及預防肝功能衰竭有積極的指導意義。
　　目的：
　　通過檢測miR-27a和miR-27b兩個亞型及Tmub1在大鼠肝切除術后不同時間段的表達情況，分析miR-27a/b與Tmub1的表達相關性，從而明確在肝再生過程中miR-27a/b在Tmub1基因表達調(diào)控中的作用。
　　方法：
　　1.選取SD雄

4、性大鼠40只，體重在160-200g，隨機分為肝部分切除術組(PH group、實驗組)和剖腹探查組（sham group、假手術組）。并依次提取肝部分切除術后0h、12h、24h、48h、72h的肝組織及原代肝細胞。
　　2.采用miRNA分析軟件TargetScan和microRNA.org對Tmub1基因進行生物信息學分析。
　　3.利用Real-time PCR檢測術后不同時間段各組肝組織內(nèi)miR-27a/b兩個亞型

5、與Tmub1 mRNA的量，并利用western blot技術檢測術后不同時間段各組肝組織內(nèi)Tmub1蛋白量，從而分析出miR-27a/b兩個不同的亞型與Tmub1表達的時間相關性。并利用熒光素酶報告基因技術，分析miR-27a/b與Tmub1 mRNA的結合活性。
　　結果：
　　1.生物信息學檢測結果:Tmub1基因3'UTR序列中存在一處miR-27a/b潛在結合位點，同時我們運用反向分析法分析miR-27a/b后發(fā)現(xiàn)

6、，Tmub1同樣是miR-27a及miR-27b的目的基因。
　　2.Real-time PCR實驗結果提示，通過與假手術組比較發(fā)現(xiàn)，肝切除術后12h、24h、48h、72h，miR-27a/b表達有不同程度的下降(P＜0.05)，而在0h表達無明顯差異(P＞0.05)。同時我們檢測PH組及假手術組術后Tmub1 mRNA不同時間段的表達情況，發(fā)現(xiàn)在PH術后12h、24h、48h、72h，Tmub1 mRNA的量較假手術組明顯升高

7、(P＜0.05)。且miR-27a/b及Tmub1 mRNA的量在術后24h及48h改變最為明顯。
　　3.western blot表明，正常肝細胞中Tmub1微量表達，PH術后12h，大鼠肝細胞中的Tmub1蛋白表達開始增加，且于術后48h達高峰，與假手術組相比，肝部分切除術組在術后(12h、24h、48h、72h)的Tmub1表達量均明顯升高(P＜0.05)，而肝部分切除術組術后0hTmub1蛋白的表達無明顯差異(P＞0.05

8、)。
　　4.熒光素酶報告基因檢測結果提示:miR-27a/b模擬物與Tmub1報告基因載體共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性明顯下降，且miR-27b的作用更為明顯，提示miR-27a/b兩個亞型都可以與Tmub1基因結合發(fā)揮表達調(diào)控作用。
　　結論：
　　本研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a和miR-27b兩個亞型均可以負向調(diào)控Tmub1的表達，而且miR-27b的作用稍強。因此miR-27a/b可以通過參與Tmub1基因的表達調(diào)控過程