TXNIP在糖尿病腎組織脂質沉積中的作用及機制研究.pdf

1、目的：糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病所致的全身微血管病變的腎臟表現(xiàn),主要以腎小球系膜細胞增生及細胞外基質沉積，腎小管上皮細胞凋亡及轉分化，腎小球硬化和間質纖維化為主要病理特征。DN的發(fā)病機制非常復雜，一直是國內外腎臟病學領域研究的重點。過去十年的研究發(fā)現(xiàn)，腎臟固有細胞的脂質代謝紊亂是糖尿病腎損傷發(fā)生的重要病理生理基礎。高糖狀態(tài)下脂質成分在腎細胞內異常沉積，可造成腎細胞的慢性功能紊亂和細胞損傷。用基

2、因學或藥學方法干預糖尿病動物模型體內脂質生成基因的表達，如固醇調節(jié)因子結合蛋白（sterol regulatory element binding protein，SREBPs）及過氧化物酶增殖活化受體（Peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR），可改善糖尿病引起的腎臟損傷，說明脂質代謝紊亂在DN發(fā)病過程中發(fā)揮了關鍵作用。
　　硫氧還蛋白相互作用蛋白（thioredoxin i

3、nteraction protein，TXNIP）或硫氧還蛋白結合蛋白-2（thioredoxin binding protein-2，TBP-2），又稱維生素D3上調蛋白1（vitamin D3-upregulated protein1，VDUP-1）是一種內在的硫氧還蛋白（thioredoxin, Trx）調節(jié)蛋白，其可與Trx結合而抑制其功能，從而誘導細胞發(fā)生過氧化反應。多項研究提示TXNIP參與了糖尿病腎病的發(fā)生，高糖能夠顯著上

4、調腎臟細胞TXNIP蛋白和mRNA的表達。新近有研究顯示，TXNIP在肝臟脂代謝紊亂導致的脂肪肝方面發(fā)揮了調節(jié)作用。在1型糖尿病相關的非酒精性脂肪性肝病大鼠模型中，伴隨肝臟脂質沉積，TXNIP的表達明顯增高，中藥槲皮素和別嘌呤醇通過抑制肝臟TXNIP的表達減輕了肝臟的脂質沉積。TXNIP基因敲除小鼠通過抑制 PRMT1-PGC-1α信號途徑的激活改善了高脂飲食所致的脂肪肝。但TXNIP在糖尿病導致的腎臟脂質沉積中是否也具有調節(jié)作用還未見

5、報道。
　　本研究應用1型和2型兩種不同的糖尿病小鼠模型和體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞HK-2，從整體、細胞和分子等不同水平，系統(tǒng)全面地觀察了TXNIP在糖尿病腎臟脂質沉積中的作用及調節(jié)機制，并觀察了天然抗氧化劑花青素對高糖條件下腎小管上皮細胞TXNIP的表達及脂質沉積的影響，為進一步闡明糖尿病腎病的發(fā)病機制及其防治提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1糖尿病腎病患者腎組織TXNIP、SREBP-1和PPARα的表達及脂質沉積

6、
　　收集2010年10月~2014年10月在保定市第一中心醫(yī)院腎內科住院，經(jīng)病史、臨床檢查及腎穿刺活檢病理診斷為糖尿病腎病患者20例（diabetic nephropathy group），既往無其它腎臟病史，以10例腎臟腫瘤患者切除的腎臟遠端瘤旁組織做為對照組（control group）。留取血和尿標本檢測血糖（Glu）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、血膽固醇（TC）、血甘油三酯（TG）、24小時尿蛋白定量（UPE）、肌酐（S

7、cr）、估算腎小球濾過率（eGFR）等。采用油紅O染色檢測細胞內脂滴形成；免疫組織化學檢測TXNIP、SREBP-1及PPARα蛋白表達。
　　2 TXNIP基因敲除對STZ誘導的糖尿病小鼠腎組織脂質沉積的影響
　　6~8周齡C57BL/6J背景的野生型小鼠（Wild type）及TXNIP基因敲除鼠（TXNIP-/-）為動物模型。將實驗動物隨機分為4組，野生型C57BL/6J小鼠組(WT)、糖尿病組(WT+STZ)、TXN

8、IP基因敲除組（TKO）和TXNIP基因敲除+糖尿病組（TKO+STZ）。每組10只，WT+STZ和 TKO+STZ組小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，溶于0.1mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中，pH值4.5，50mg/kg/day），連續(xù)注射5天；對照組注射相同體積的枸櫞酸鹽緩沖液，5天后血糖儀測定空腹血糖，血糖≥11.1mmol/L且尿糖陽性者（+++~++++）確定為DM模型。實驗期間動物自由進食和飲水，每周

9、測一次血糖。DM小鼠成模20周后處死小鼠，收集血尿標本，用于生化指標檢測，切取部分腎組織分別置于4％多聚甲醛和4%的戊二醛固定液中固定，用于光鏡、免疫組織化學和電鏡檢測；部分腎皮質組織用于提取蛋白及RNA，Western blot檢測TXNIP、SREBP-1、PPARα、FASN、ACC、ACOX1、CPT1、p-Akt、Akt、p-mTOR和mTOR蛋白表達，Real-time PCR檢測SREBP-1、PPARα、FASN、ACC

10、、ACOX1和CPT1表達，油紅O染色檢測小鼠腎組織脂滴形成情況。
　　3敲低TXNIP對高糖誘導的腎小管細胞HK-2脂質沉積的影響
　　人腎小管上皮細胞HK-2在37℃，5%CO2條件下，以含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。⑴檢測高糖對HK-2細胞TXNIP表達和脂滴形成的影響：細胞分為正常糖對照組（5.5 mmol/L glucose，NG）及高糖組（30 mmol/L glucose，HG），刺激細胞，孵育

11、0、6、12、24、48、72 h后收集細胞，Western blot及Real-time PCR檢測細胞TXNIP的表達，油紅O染色檢測細胞脂滴形成。⑵檢測TXNIP對高糖誘導的HK-2細胞脂質沉積的影響：使用FuGENE?HD轉染試劑將TXNIP shRNA Plasmid(T)干擾質粒和空白質粒（V）分別轉染人腎小管上皮HK-2細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選濃度（4μg/mL）篩選穩(wěn)定的細胞系。細胞隨機分為正常糖對照組（5.5 mmol/L

12、 glucose，NG）、高滲對照組（5.5 mmol/L glucose+24.5 mmol/L mannitol，M）、高糖組（30 mmol/L glucose，HG）、高糖+空白質粒組（30 mmol/L glucose+Vector，HG+V）、高糖+TXNIP shRNA質粒組（30 mmol/L glucose+TXNIP shRNA，HG+T）。細胞分組刺激48h后，Western blot檢測TXNIP、SREBP-1

13、、PPAR?、FASN、ACC、ACOX1、CPT1、p-Akt、Akt、p-mTOR和mTOR蛋白表達；Real-time PCR檢測TXNIP、SREBP-1、PPARα、FASN、ACC、ACOX1和CPT1 mRNA表達；流式細胞儀檢測細胞ROS的變化；油紅O染色檢測細胞脂滴形成；試劑盒檢測細胞內甘油三酯含量。⑶檢測 PI3K/Akt/mTOR信號通路在高糖誘導的HK-2細胞脂質沉積中的意義：細胞隨機分為正常糖對照組（5.5 m

14、mol/L glucose， NG）、正常糖+LY294002組（5.5 mmol/L glucose+10μmol/L LY294002， NG+LY）、高滲對照組（5.5 mmol/L glucose+24.5 mmol/L mannitol，M）、高糖組（30 mmol/L glucose，HG）、高糖+LY294002組（30 mmol/L glucose+10μmol/L LY294002，HG+LY）。檢測方法及指標同上。<

15、br>　　4天然抗氧化劑花青素對高糖誘導的腎小管上皮細胞 TXNIP的表達及脂質沉積的影響
　　①動物實驗：16只雄性db/db小鼠隨機抽取8只做為糖尿病腎病模型組（db/db group，db/db）、余下8只為葡萄籽原花青素治療組（grape seed proanthocyanidin extract treatment group，db/db+GSPE）；16只db/m小鼠隨機抽取8只作為正常對照組（db/m），余下8只為葡

16、萄籽原花青素治療對照組（grape seed proanthocyanidin extract treatment control group，db/m+GSPE）。db/db+GSPE組和db/m+GSPE組給予5 mg/kg/day葡萄籽原花青素灌胃，持續(xù)8周，對照組和模型組給予相同體積生理鹽水。實驗期間動物自由進食和飲水，每2周測一次血糖及體重。小鼠15周齡時處死小鼠，收集血尿標本，用于生化指標檢測，切取部分腎組織分別置于4%多聚

17、甲醛和4%的戊二醛固定液中固定，用于光鏡、免疫組織化學和電鏡檢測；部分腎皮質組織用于提取蛋白及RNA，Western blot檢測TXNIP、SREBP-1、PPARα、FASN、ACC、ACOX1和CPT1蛋白表達， Real-time PCR檢測SREBP-1、PPARα、FASN、ACC、ACOX1和CPT1表達，油紅O染色檢測小鼠腎組織脂滴形成情況。
　?、诩毎麑嶒灒喝四I小管上皮細胞HK-2在37℃，5%CO2條件下，以含

18、10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。⑴檢測花青素對HK-2細胞細胞活力及ROS產(chǎn)生的影響：細胞用含10、20、50、100μM的C3G或Cy刺激物的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞48 h，MTT法檢測細胞活力，流式細胞儀檢測細胞ROS的變化。⑵檢測花青素對高糖誘導的HK-2細胞TXNIP表達及脂質沉積的影響：細胞隨機分為正常糖對照組（5.5 mmol/L glucose，NG）、高滲對照組（5.5 mmol/L glucose+24.5 mmo

19、l/L mannitol，M）、高糖組（30 mmol/L glucose，HG）、高糖+C3G組（30 mmol/L glucose+C3G，HG+C3G）、高糖+Cy組（30 mmol/L glucose+Cy，HG+Cy）。細胞分組刺激48h后，Western blot檢測TXNIP、SREBP-1、PPAR?、FASN、ACC、ACOX1和CPT1蛋白表達；Real-time PCR檢測SREBP-1、PPARα、FASN、AC

20、C、ACOX1和CPT1 mRNA表達；流式細胞儀檢測細胞ROS的變化；油紅O染色檢測細胞脂滴形成。
　　結果：
　　1糖尿病腎病患者臨床病理表現(xiàn)及相關蛋白檢測
　?、俟忡R下觀察：對照組腎小球毛細血管袢開放良好，腎小管及間質未見明顯異常；糖尿病腎病組腎小球體積增大，基底膜不規(guī)則增厚，系膜細胞及系膜基質增生，晚期腎小球硬化；腎小管基底膜增厚，部分小管萎縮，部分小管代償性肥大，間質纖維化。②糖尿病腎病組患者空腹血糖、糖化血

21、紅蛋白、尿蛋白量、肌酐較對照組均明顯增多，而腎小球濾過率糖尿病腎病組患者比對照組下降（P<0.05或P<0.01）。③對照腎組織中未見明顯脂質沉積，糖尿病腎病組腎小管上皮細胞內出現(xiàn)大量脂滴，呈紅染顆粒狀。④免疫組化顯示，糖尿病腎病組TXNIP和SREBP-1在腎小管上皮細胞胞漿中表達增多， PPARα在腎小球及腎小管上皮細胞胞漿表達減少，與對照組相比有顯著性差異（P<0.01）。
　　2 TXNIP基因敲除對STZ誘導的糖尿病小鼠

22、腎組織脂質沉積的影響
　?、俟忡R下觀察，糖尿病小鼠腎小球體積略增大，系膜細胞增生伴系膜基質增多，基底膜不規(guī)則增厚，腎小管上皮細胞出現(xiàn)空泡變性；TXNIP基因敲除明顯改善了糖尿病所致的腎臟形態(tài)學變化。②與WT小鼠相比，糖尿病小鼠BUN、Scr、TG及UAE均顯著升高；TXNIP基因敲除各項指標明顯下降（P<0.05或P<0.01）。③電鏡及油紅O染色顯示糖尿病小鼠近曲小管上皮細胞胞漿內呈現(xiàn)明顯的脂滴沉積，腎組織內甘油三酯和膽固醇含量

23、明顯高于 WT小鼠；TXNIP基因敲除的糖尿病小鼠小管細胞內脂滴數(shù)減少，甘油三酯及膽固醇含量降低（P<0.01）。④與WT小鼠比較，糖尿病小鼠腎組織內TXNIP、SREBP-1、FASN、ACC、p-Akt及p-mTOR表達明顯增高，而PPARα、CPT1及ACOX1的表達減少；TXNIP基因敲除下調了TXNIP、SREBP-1、FASN、ACC、p-Akt及p-mTOR的表達，上調了 PPARα、CPT1及 ACOX1的表達，均有統(tǒng)計

24、學意義（P<0.05或P<0.01）。
　　3敲低TXNIP對高糖誘導的腎小管細胞HK-2脂質沉積的影響
　?、倥cNG相比，HG組HK-2細胞中TXNIP表達明顯增高，呈時間依賴性；TXNIP shRNA質粒轉染明顯降低了HG誘導TXNIP蛋白的表達。油紅O染色顯示細胞內脂滴數(shù)明顯增加，與刺激時間成正比。② TXNIP shRNA質粒轉染抑制了HG誘導的HK-2細胞脂滴形成及甘油三酯含量的增加（P<0.01）。③與NG組相比

25、，HG組SREBP-1、FASN和ACC表達明顯增加，Akt和mTOR的磷酸化水平升高，PPARα、CPT1及ACOX1表達減少；TXNIP shRNA質粒轉染能夠降低HG誘導的SREBP-1、FASN和ACC表達增加及Akt和mTOR的磷酸化水平升高，上調PPAR?、CPT1及ACOX1表達（P<0.05或P<0.01）。甘露醇及空白質粒無影響。④與HG組相比，LY294002抑制了 Akt和 mTOR的磷酸化水平升高，降低SREBP

26、-1、FASN及ACC的表達，增加PPAR?、CPT1及ACOX1的表達；抑制了細胞內甘油三酯含量的增加（P<0.05或P<0.01）。
　　4天然抗氧化劑花青素對高糖誘導的腎小管上皮細胞 TXNIP的表達及脂質沉積的影響
　　①光鏡下觀察，db/db小鼠腎小球體積略增大，系膜細胞增生伴系膜基質增多，基底膜不規(guī)則增厚，腎小管上皮細胞出現(xiàn)空泡變性；葡萄籽原花青素（GSPE）干預明顯改善了糖尿病所致的腎臟形態(tài)學變化。與db/m小

27、鼠相比，db/db小鼠FBG、BUN、Scr、TG、TC及UAE均顯著升高；葡萄籽原花青素（GSPE）干預各項指標明顯下降（P<0.05或P<0.01）。②電鏡及油紅O染色顯示db/db小鼠近曲小管上皮細胞胞漿內呈現(xiàn)明顯的脂滴沉積，腎組織內甘油三酯和膽固醇含量明顯高于db/m小鼠；葡萄籽原花青素（GSPE）干預后脂滴數(shù)減少，甘油三酯及膽固醇含量降低。③與db/m小鼠比較，db/db小鼠腎組織內TXNIP、SREBP-1、FASN及ACC

28、表達明顯增高，而PPARα、CPT1及ACOX1的表達減少；葡萄籽原花青素（GSPE）干預后TXNIP、SREBP-1、FASN及ACC表達減少，PPARα、CPT1及ACOX1的表達增加，均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。④花青素干預能夠明顯抑制HG誘導HK-2細胞TXNIP表達、ROS的生成及脂滴沉積（P<0.05或P<0.01）。⑤與NG組相比，HG組SREBP-1、FASN和ACC表達明顯增加， PPARα、CPT1

29、及ACOX1表達減少；花青素干預能夠降低HG誘導的SREBP-1、FASN和ACC表達增加，上調PPARα、CPT1及ACOX1表達（P<0.05或P<0.01）。甘露醇及空白質粒無影響。
　　結論：
　　1在糖尿病患者及小鼠模型腎組織和體外培養(yǎng)的HK-2細胞中均發(fā)現(xiàn)高糖顯著誘導了TXNIP的表達，同時腎小管上皮細胞出現(xiàn)明顯的脂質沉積，提示TXNIP可能參與了腎小管上皮細胞異常的脂質代謝過程。
　　2 TXNIP基因敲