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3、同造成不良后果由本人自負(fù)。 本人簽署本授權(quán)書一份,交圖書館留存。 學(xué)位論文作者暨授權(quán)人(親筆)簽字: 葛令苗 2015 年 5 月 26 日 南開(kāi)大學(xué)研究生學(xué)位論文作者信息 論 文 題 目 論 文 題 目 重組人表皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)純化及其凝膠劑的制備 重組人表皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)純化及其凝膠劑的制備 姓 名 姓 名 葛令苗 葛令苗 學(xué)號(hào) 學(xué)號(hào) 2120120961 2120120961 答 辯 日
4、 期 答 辯 日 期 2 0 1 5 2 0 1 5 年 5 5 月 2 0 2 0 日 論 文 類 別 論 文 類 別 博士 博士 □ 學(xué)歷碩士 學(xué)歷碩士 √ 專業(yè)學(xué)位碩士 專業(yè)學(xué)位碩士 □ 同等學(xué)力碩士 同等學(xué)力碩士 □ 劃 √ 選 擇 選 擇 學(xué) 院 學(xué) 院 ( 單 位 單 位 ) 生命科學(xué)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 學(xué) 科 學(xué) 科 / 專 業(yè) 專 業(yè) ( 專 業(yè) 學(xué) 位 專 業(yè) 學(xué) 位
5、 ) 名 稱 名 稱 生物化學(xué)與分子生物學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué) 聯(lián) 系 電 話 聯(lián) 系 電 話 13821352729 13821352729 電 子 郵 箱 電 子 郵 箱 gelingmiao@163.com gelingmiao@163.com 通信地址 通信地址(郵編 郵編): 天津市南開(kāi)區(qū)衛(wèi)津路 天津市南開(kāi)區(qū)衛(wèi)津路 94 94 號(hào) 南開(kāi)大學(xué)( 南開(kāi)大學(xué)(300071 300071) 非 公 開(kāi) 論 文 編 號(hào) 非 公 開(kāi)
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7、價(jià)值;研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細(xì)胞中的表皮生長(zhǎng)因子異常增加,因而 EGF 也可以作為抗腫瘤的靶點(diǎn);在化妝品領(lǐng)域,添加了EGF 的化妝品可以促進(jìn)膠原蛋白的合成,活化皮膚細(xì)胞,對(duì)延緩細(xì)胞衰老起到很好的效果。 為了簡(jiǎn)單高效的獲得 EGF,本論文設(shè)計(jì)并實(shí)施了創(chuàng)新的融合表達(dá)與純化策略。 首先本文人工合成編碼 EGF 的基因, 并在其前端加入編碼 DDDDK 序列 (腸激酶識(shí)別位點(diǎn):-(Asp)4-Lys-) ,插入到 pET-GST-3C 載體上,獲得大
8、腸桿菌 EGF融合表達(dá)系統(tǒng)。經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)表達(dá),高壓破碎菌體,包涵體復(fù)性,EGF 融合蛋白GST 親和層析純化,腸激酶切去標(biāo)簽蛋白,并進(jìn)一步經(jīng)過(guò) 10 kD 的超濾膜分離純化獲得 EGF 粗品。最后再經(jīng) HPLC 分離制備 EGF,純度高達(dá) 95.41%。經(jīng)過(guò)蛋白電泳鑒定為 6.0 kD, 與預(yù)期一致。 紫外光譜掃描儀掃描, 最大吸收峰在 270 nm。經(jīng)計(jì)算,重組 EGF 的產(chǎn)量為 53.056 mg/L。 其次,鑒于腸激酶切割融
9、合蛋白具有高度專一性和切割效率高的優(yōu)點(diǎn),本文優(yōu)化了畢赤酵母分泌表達(dá)腸激酶的條件: 甲醇濃度為 1.5 %、 誘導(dǎo)溫度為 27 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間為 100 h, 得到腸激酶的酶活為 30.10 IU/mL。 經(jīng)計(jì)算一個(gè)酶活單位最終酶切 2.28 μgEGF 融合蛋白。 凝膠劑生物相容性優(yōu)良, 能發(fā)揮持續(xù)的藥物釋放效果。 最后本文優(yōu)化了 EGF凝膠劑的成分配方, 其最佳計(jì)量為焦亞硫酸鈉 0.10 g, 乙二胺四乙酸二鈉 0.01 g,甘油 5
10、g, 卡波姆基質(zhì) 1.00 g 溶脹、 三乙醇胺約 1.35 g 中和成透明凝膠、 加入 2 mL含有 1.0 mgEGF 的溶液,攪拌均勻后加注射用水至 100 g。所制備的凝膠劑可以成功釋放 EGF,能促進(jìn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Balb/c3T3)的增殖,經(jīng)測(cè)定生物活性為 6.32 x 105 IU(1.0 mg)/100g。 國(guó)內(nèi)關(guān)于 EGF 的研究, 大多是融合表達(dá)重組 EGF, 對(duì)獲得 EGF 融合表達(dá)純化的報(bào)道較少,加之市場(chǎng)上
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