共抑制分子VISTA胞外段重組蛋白表達(dá)及其對EAE小鼠治療作用的研究.pdf

1、研究背景：共刺激分子參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化/凋亡，其中負(fù)性共刺激分子（共抑制分子）能夠產(chǎn)生負(fù)性信號，削弱、限制或中止免疫應(yīng)答，它可以誘導(dǎo)免疫耐受的形成并且維持外周耐受，從而阻止自體免疫發(fā)生。大量研究表明，共抑制分子在多發(fā)性硬化癥/實(shí)驗(yàn)性腦脊髓炎（MS/EAE）的病程中發(fā)揮重要的作用，是治療MS/EAE的潛在靶點(diǎn)。
　　VISTA（V-domain Ig suppressor of Tcell activation）是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的共抑

2、制分子，也被稱為PD-1H（Programmed death-1 homolog），屬于Ig超家族的成員之一。VISTA廣泛表達(dá)于造血細(xì)胞表面，在抗原呈遞細(xì)胞（APCs）及 T細(xì)胞表面也有表達(dá)，且VISTA無論表達(dá)在APCs上還是T細(xì)胞上，均表現(xiàn)出對T細(xì)胞應(yīng)答的抑制作用。已有研究證實(shí)VISTAKO2D2轉(zhuǎn)基因小鼠的EAE發(fā)病程度、發(fā)病率均高于野生型2D2小鼠，表明VISTA會增加EAE自發(fā)的敏感性，與MS/EAE自身免疫疾病密切相關(guān)。<

3、br>　　為探討VISTA對EAE小鼠病情的影響，本研究在不同的蛋白表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)VISTA胞外段重組蛋白并驗(yàn)證其活性；同時(shí)構(gòu)建 EAE小鼠模型，研究VISTA基因的表達(dá)與 EAE小鼠病程進(jìn)展的關(guān)系及VISTA胞外段重組蛋白對EAE小鼠病情的影響。
　　研究方法：
　　1、構(gòu)建原核表達(dá)載體pET22b-VISTA，表達(dá)并純化VISTA胞外段重組蛋白，使用CCK8法驗(yàn)證其對脾臟細(xì)胞的增殖的影響以驗(yàn)證其活性；
　　2、構(gòu)建

4、酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA-VISTA，甲醇誘導(dǎo)VISTA胞外段重組蛋白的表達(dá)；構(gòu)建哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pFUSE-VISTA-mIgG2a，脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，瞬時(shí)表達(dá)重組蛋白，RT-PCR及Western Blot檢驗(yàn)重組蛋白表達(dá)；
　　3、利用MOG35-55抗原肽免疫C57BL/6小鼠，建立EAE模型，通過Real-time PCR檢測VISTA在EAE小鼠不同病程時(shí)期腦組織及脾臟組織中的表達(dá)；
　　4、建立

5、預(yù)防性給藥方案，VISTA胞外段重組蛋白給藥治療EAE小鼠，通過神經(jīng)功能評分、病理學(xué)檢測及Real-time PCR檢測EAE小鼠發(fā)病高峰期腦組織及脾臟組織中IFN-γ的表達(dá)，研究VISTA胞外段重組蛋白對EAE小鼠的治療作用。
　　研究結(jié)果：
　　1、成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET22b-VISTA并獲得VISTA胞外段重組蛋白，純化后的VISTA胞外段重組蛋白對ConA刺激的脾臟細(xì)胞具有顯著抑制作用；
　　2、構(gòu)建重組

6、質(zhì)粒pPICZaA-VISTA，成功誘導(dǎo)表達(dá)VISTA胞外段重組蛋白；構(gòu)建哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pFUSE-VISTA-mIgG2a，經(jīng)驗(yàn)證VISTA胞外段重組蛋白成功表達(dá)；
　　3、成功建立EAE小鼠模型，發(fā)病率為100％（經(jīng)神經(jīng)功能評分及病理學(xué)檢測證明）。通過Real-time PCR檢測不同病程時(shí)期VISTA基因在脾臟及腦組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示VISTA的表達(dá)隨病程變化。
　　4、在預(yù)防性給藥方案下，VISTA胞外段重組蛋白

7、治療EAE小鼠能夠顯著減弱疾病的發(fā)病程度：EAE組小鼠發(fā)病率為100%，給藥組的發(fā)病率為71%；給藥組發(fā)病起始時(shí)間為14.40±0.60天，顯著遲于EAE組（12.14±0.40天，**p<0.01）；給藥組的平均神經(jīng)功能評分遠(yuǎn)低于同時(shí)期EAE組小鼠；腦組織和脊髓組織的H&E染色結(jié)果顯示，給藥組較EAE組脊髓炎性細(xì)胞浸潤程度顯著減弱（***P<0.001），給藥組小鼠腦組織炎性細(xì)胞浸潤程度比 EAE組輕，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。脊髓組織LFB染

8、色表明給藥組脫髓鞘現(xiàn)象明顯減輕。且無論在腦組織或脾臟組織中，VISTA胞外段重組蛋白給藥組IFN-γ基因表達(dá)都顯著低于EAE模型組小鼠。
　　結(jié)論：本研究通過基因工程手段成功獲得pET22b-VISTA重組載體，通過誘導(dǎo)、表達(dá)、純化獲得了具有生物活性的VISTA胞外段重組蛋白；使用MOG35-55免疫小鼠，成功構(gòu)建了EAE小鼠模型，經(jīng)Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)VISTA基因在脾臟及腦組織中的表達(dá)隨著EAE小鼠病程變化，證明