基于HCR及生物素-鏈霉親和素信號放大系統(tǒng)檢測大腸桿菌O157-H7的研究.pdf

1、大腸桿菌O157:H7是大腸桿菌中的一種具有高致病性的食源性致病血清型，有報道稱低于10個菌就能夠致病，如何快速靈敏地檢測大腸桿菌O157:H7引起了廣泛關(guān)注。因此，本文分別建立了傳統(tǒng)ELISA方法、基于生物素–鏈霉親和素信號放大的ELISA方法、集成雜交鏈式反應(yīng)和生物素–鏈霉親和素信號放大的ELISA方法，旨在找到一種準確快速的ELISA方法高靈敏檢測大腸桿菌O157:H7。
　　本文首先采用傳統(tǒng)的雙抗夾心ELISA方法檢測大腸

2、桿菌O157:H7。通過優(yōu)化抗大腸桿菌O157:H7單克隆抗體的濃度，傳統(tǒng)的ELISA方法在培養(yǎng)基和牛奶樣品當(dāng)中的靈敏度分別為4.88×104 CFU/mL和5.08×104 CFU/mL，變異系數(shù)分別為1.31％–6.87%和1.52%–7.81%。
　　采用生物素–鏈霉親和素信號放大ELISA方法檢測大腸桿菌O157:H7，通過優(yōu)化生物素化抗大腸桿菌O157:H7單克隆抗體濃度，在培養(yǎng)基和牛奶樣品中靈敏度分別為2×104 CF

3、U/mL和3.23×104 CFU/mL，變異系數(shù)分別為1.12%–8.63%和1.25%–9.61%。兩種傳統(tǒng)ELISA方法特異性良好，變異系數(shù)低，穩(wěn)定性好，均能實現(xiàn)對牛奶樣品的加標檢測，但兩種方法的靈敏度都較低。
　　本文最后構(gòu)建了基于HCR及生物素–鏈霉親和素信號放大系統(tǒng)的雙抗夾心ELISA方法，實現(xiàn)了對大腸桿菌O157:H7的快速靈敏檢測。將大腸桿菌O157:H7的多抗包被在酶標板之后，加入標記了大腸桿菌O157:H7單抗

4、和DNA1引發(fā)序列的膠體金復(fù)合物。當(dāng)存在目標菌株時，將會形成多抗–目標菌–單抗–膠體金–DNA1復(fù)合物。復(fù)合物與加入的生物素化H1和生物素化H2發(fā)生雜交鏈式反應(yīng)，形成一個帶缺口的包含大量生物素的雙鏈結(jié)構(gòu)DNA，生物素將與鏈霉親和素化的酶發(fā)生酶催化底物顯色反應(yīng)。通過優(yōu)化膠體金探針單抗、多抗、生物素化H1及H2加入濃度，DNA1標記量，封閉劑的選擇，HCR反應(yīng)時間，酶反應(yīng)動力學(xué)時間及溫度，得到的最優(yōu)條件為：單抗標記量150μg/mL；多抗包

5、被濃度10μg/mL；生物素化H1及H2加入濃度0.25 nmol/mL；DNA1標記量400μL（1 nmol/mL）；封閉劑選擇為3% BSA；HCR反應(yīng)時間為75min；酶反應(yīng)動力學(xué)時間和溫度分別為10 min和37℃。在最優(yōu)條件下，大腸桿菌O157:H7的檢測線性范圍為5×102–1×107 CFU/mL，在培養(yǎng)基和牛奶樣品中靈敏度分別為1.08×102 CFU/mL和2.60×102 CFU/mL。特異性實驗表明該方法特異性良