木瓜蛋白酶具有水解殼聚糖活性的酶組分分離純化研究.pdf

1、木瓜蛋白酶能非專一性地水解殼聚糖，但其水解殼聚糖的作用方式和水解機(jī)理等方面仍不清楚。本論文研究木瓜蛋白酶具有水解殼聚糖活性成分的分離和純化，對于進(jìn)一步闡明非專一性酶水解殼聚糖的作用機(jī)理具有重要的學(xué)術(shù)意義，同時(shí)對于酶法生產(chǎn)甲殼低聚糖具有重要的應(yīng)用價(jià)值。 首先對五種商品木瓜蛋白酶制劑降解殼聚糖的活性進(jìn)行比較，從中篩選出一種降解殼聚糖活性較高的木瓜蛋白酶Ⅱ，作用于不同脫乙酰度殼聚糖的結(jié)果表明，此酶的最佳底物是殼聚糖Ⅰ，脫乙酰度為85.

2、7％。木瓜蛋白酶Ⅱ降解殼聚糖的最適條件是底物濃度0.5％、pH4.0、40℃、酶底物比10％。在最適條件下木瓜蛋白酶Ⅱ降解殼聚糖時(shí)，30min 內(nèi)導(dǎo)致粘度下降百分比達(dá)到70.77％，1h之后粘度變化平緩。采用Sepharose CL-6B 凝膠柱測定木瓜蛋白酶Ⅱ降解殼聚糖6h 和加滅活酶反應(yīng)產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布，結(jié)果顯示木瓜蛋白酶Ⅱ降解殼聚糖產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量主要集中在11943 到2899；加滅活酶反應(yīng)產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量主要集中在35

3、490 到10162。 采用截留相對分子質(zhì)量為10000 的中空纖維膜對木瓜蛋白酶Ⅱ進(jìn)行超濾濃縮分離，室溫下最佳操作壓力為0.1MPa，超濾濃縮倍數(shù)為8 倍時(shí)，可以得到最高具有殼聚糖酶活性的組分。超濾后木瓜蛋白酶Ⅱ的蛋白酶和殼聚糖酶比活力分別從435.10U/mg 和2.17U/mg 提高到531.39U/mg 和2.65U/mg，純化倍數(shù)均提高了1.22 倍。SDS-PAGE 圖譜顯示，超濾去除了相對分子質(zhì)量小于10000 的

4、雜蛋白，其純度得以提高。成分分析表明，超濾后的木瓜蛋白酶制劑中還原糖含量由57.46％降至6.27％。 采用制備型聚丙烯酰胺凝膠電泳分離純化超濾后的木瓜蛋白酶Ⅱ，膠濃度為10％的分離膠、4％的濃縮膠。制備電泳圖譜上顯示有五條明顯的酶條帶，酶活性測定顯示條帶2 具有較高的殼聚糖酶活性，對該條帶進(jìn)行富集獲得具有殼聚糖酶活性的單一酶組分。采用SDS-PAGE 和HPLC 對此純化酶組分進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果顯示為單一條帶和單一峰，說明木瓜

5、蛋白酶Ⅱ中存在具有水解殼聚糖的酶組分。LC-MS/MS 測定該純化酶組分的氨基酸序列為MRITISGSPGSGTTTLGRSI AEKYSYRYVS AGEVFRGLAK ERNMDLAAFG KIAETDPAIDLEIADARQKEI GESSDDIILE GRLAGWMVEN ADLKILLCAS PECRSTRIAAREGLTEKQAF EMTIEREACE AGRYMEYYEI DILDFSPYDL ILNSETFSANELFA