活化性T淋巴細(xì)胞核因子5在煙霧吸入性急性肺損傷中的作用研究.pdf

1、據(jù)統(tǒng)計(jì)，約5％～10％燒傷患者并發(fā)吸入性肺損傷，重度死亡率可達(dá)80％以上，是早期燒傷患者主要的死因之一。雖然針對(duì)吸入性損傷的研究一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，但其關(guān)鍵因素始終未能得到突破性進(jìn)展，從而導(dǎo)致其死亡率居高不下。因此，對(duì)肺損傷的確切發(fā)病機(jī)制及有效的主動(dòng)性干預(yù)措施的研究實(shí)屬必要。
　　研究發(fā)現(xiàn)，在急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制中核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)有著重要作用。特異性抑制NF-κB信號(hào)通路的

2、活化可減少炎癥的級(jí)聯(lián)放大，控制吸入性損傷的病變程度及減緩疾病進(jìn)程。然而，由于NF-κB作用的時(shí)間和空間上的特異性，NF-κB信號(hào)通路的抑制劑尚未取得成功。微小RNA(microRNAs，miRNAs)技術(shù)的出現(xiàn)，為這一難題的解決提供了可能。
　　miRNAs是具有調(diào)節(jié)作用小分子非編碼RNA，能夠與靶mRNA的3'非編碼區(qū)特異性結(jié)合，介導(dǎo)翻譯抑制或誘導(dǎo)降解，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控。miRNAs在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)以及免疫方面的作用已經(jīng)引起

3、廣泛關(guān)注，然而，關(guān)于miRNAs在煙霧吸入性急性肺損傷的相關(guān)功能研究鮮有報(bào)道。miR-155是miRNAs重要一員，在免疫及炎癥方面具有重要的作用，但在煙霧吸入性急性肺損傷研究尚未見報(bào)道。
　　活化性T淋巴細(xì)胞核因子5(nuclear factor of the activated T cell5，NFAT5)屬于Rel家族蛋白，因參與滲透壓的調(diào)節(jié)而被大家所了解。此外，NFAT5還可誘導(dǎo)促炎因子的表達(dá)，促進(jìn)炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展。因此

4、，我們猜測(cè)既然炎癥發(fā)生、發(fā)展與煙霧吸入性急性肺損傷有關(guān)，那么NFAT5是否也與煙霧吸入性急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制有關(guān)？其相關(guān)研究國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)采用大鼠煙霧吸入性急性肺損傷模型，在基因及分子水平對(duì)煙霧吸入性急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究，探究:①NFAT5是否參與了煙霧吸入性肺損傷？②NFAT5功能的調(diào)控因子miR-155的篩選及功能驗(yàn)證。③NFAT5在煙霧吸入性急性肺損傷發(fā)病機(jī)制的作用。我們首先建立煙霧吸

5、入性急性肺損傷大鼠動(dòng)物模型，并通過(guò)miRNA芯片檢測(cè)和表達(dá)譜芯片檢測(cè)尋找出差異性表達(dá)的miRNAs和基因(miR-155和NFAT5)。通過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)正反兩方面研究NFAT5在煙霧吸入性急性肺損傷中的功能研究。
　　方法:
　　1、煙霧吸入性急性肺損傷大鼠動(dòng)物模型建立:使用自制煙霧吸入性損傷儀，建立大鼠煙霧吸入性急性肺損傷模型，通過(guò)肺組織HE染色、肺組織濕干比及COX2的Western blot進(jìn)行驗(yàn)證;
　　2、

6、miR-155、NFAT5的篩選及相關(guān)分析:選煙霧致傷和正常大鼠各3只，煙霧致傷24小時(shí)后，對(duì)肺組織進(jìn)行microRNA芯片檢測(cè)和表達(dá)譜芯片檢測(cè)（miRNA4.0芯片數(shù)據(jù)及RTA芯片數(shù)據(jù)），篩選出差異表達(dá)明顯的miRNA及對(duì)應(yīng)的靶基因;
　　3、細(xì)胞水平對(duì)miR-155與NFAT5靶向關(guān)系的研究:利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)其靶基因;采用基因工程手段構(gòu)建靶基因-熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，并通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)鑒定miRNA與靶基因mRNA3'-U

7、TR是否互補(bǔ)結(jié)合;
　　4、miR-155功能的研究:將大鼠分為A:正常對(duì)照組:煙霧吸入性損傷組+安慰劑（生理鹽水）、B:煙霧吸入性損傷組+miRNA-155control、C:煙霧吸入性損傷組+miRNA-155mimics、D:煙霧吸入性損傷組+miRNA-155inhibitors，轉(zhuǎn)導(dǎo)治療24小時(shí)后，通過(guò)病理HE染色、酶聯(lián)免疫分析(ELISA)(炎癥因子(Tumor Necrosis Factor-alpha(TNF-α)

8、、monocyte chemotactic peptide-1(MCP-1)、(Interleukin-IL)-1β、IL-8)）、實(shí)時(shí)定量PCR(Real time PCR，RT-PCR)（TNF-α、IL-1β）、COX2的Western blot等方法研究miR-155是否能夠減輕肺損傷及降低肺組織炎性分子的表達(dá);
　　5、NFAT5在煙霧吸入性肺損傷中的實(shí)驗(yàn)研究:對(duì)煙霧致傷組和正常對(duì)照組大鼠，行Western blot和R

9、T-PCR檢測(cè)NFAT5的表達(dá)情況;并對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)治療中各分組行Western blot檢測(cè)NFAT5、P-P65、P65、COX2的表達(dá)情況;最后對(duì)基因敲除小鼠和正常小鼠煙霧致傷后24小時(shí)，行病理HE染色和Western blot檢測(cè)NFAT5、P-P65和COX2，進(jìn)一步驗(yàn)證靶基因及相關(guān)通路蛋白在煙霧吸入性肺損傷中作用。
　　結(jié)果:
　　1、成功建立大鼠煙霧吸入性急性肺損傷動(dòng)物模型:病理結(jié)果顯示煙霧致傷組明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn)、充血

10、及肺泡改變;肺濕干比及COX2的灰度值均顯示煙霧致傷組大于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);
　　2、miR-155、NFAT5參與煙霧吸入性急性肺損傷，且miR-155對(duì)NFAT5具有靶向調(diào)控趨勢(shì):
　　miRNA芯片篩選得到了47個(gè)差異表達(dá)的miRNA具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的分別為24和23個(gè)，超過(guò)2倍顯著差異表達(dá)的miRNAs包括:表達(dá)上調(diào)的miR-449a-5p、miR-205、mi

11、R-155-5p和表達(dá)下調(diào)的miR-92b-5p、miR-667-5p、miR-708-5p。上調(diào)的miRNAs中miR-155表達(dá)明顯上調(diào)3.46倍;RTA芯片檢測(cè)篩選得到共有30種基因差異表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表達(dá)上調(diào)的有AKR1B10、CXCL13、VSIG4和表達(dá)下調(diào)的PLP2、SCD1、NFAT5、ATP6VB2等，且miRNA芯片和RTA芯片聯(lián)合分析結(jié)果顯示miR-155對(duì)NFAT5具有靶向調(diào)控趨勢(shì);
　

12、　3、miR-155對(duì)NFAT5基因mRNA3'-UTR具有靶向調(diào)控作用:
　　Mirbase、TargetS can、PicTar預(yù)測(cè)交叉結(jié)果顯示，NFAT5基因3'UTR與miR-155存在結(jié)合互補(bǔ)位點(diǎn);構(gòu)建pMIR-NFAT5、pMIR-NFAT5-mu重組質(zhì)粒經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定正確;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)顯示:pMIR-NFAT5+miR155mimics組較pMIR-NFAT5+miR-control組熒光素酶活性降低

13、，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);
　　4、miR-155能減弱煙霧致傷大鼠的肺損傷和全身炎癥反應(yīng):
　　病理檢測(cè)結(jié)果顯示煙霧吸入性損傷組+miRNA-155mimics大鼠肺組織的炎癥充血、炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)及肺泡結(jié)構(gòu)破環(huán)程度較煙霧吸入性損傷組+miRNA-155control和煙霧吸入性損傷組+miRNA-155inhibitors明顯弱，僅次于正常對(duì)照組;ELISA、Western blot、RT-PCR等證實(shí)了過(guò)表達(dá)

14、miR-155可以減弱煙霧導(dǎo)致急性肺損傷相關(guān)蛋白COX2和炎癥因子(TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-8)的表達(dá)(P＜0.05)。
　　5、NFAT5加重?zé)熿F吸入性急性肺損傷:
　　Western blot和RT-PCR檢測(cè)煙霧致傷組和正常對(duì)照組大鼠NAFT5結(jié)果顯示煙霧致傷組的高于正常對(duì)照組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);煙霧吸入性損傷組+miRNA-155control、煙霧吸入性損傷組+miRNA-1

15、55mimics、煙霧吸入性損傷組+miRNA-155inhibitors三組大鼠肺組織標(biāo)本W(wǎng)estern Blot結(jié)果示煙霧吸入性損傷組+miRNA-155mimics大鼠肺組織NFAT5、P-P65、P65、COX2四種蛋白表達(dá)明顯低于煙霧吸入性損傷組+miRNA-155control和煙霧吸入性損傷組+miRNA-155inhibitors;NFAT5基因敲除小鼠和正常小鼠煙霧致傷后24小后，病理檢測(cè)顯示NFAT5-KO小鼠較正常